(Karosi et al 2004 [323], Karosi et al 2005 [324], Karosi et al 2005 [325])
A stapes fixáció (stapes ankylosis) kezelése műtéti úton stapedectomiával vagy stapedotomiával történik, az ovális ablak keretéről eltávolított stapest vagy stapes talpat művi implantátummal helyettesítik. A műtétek során eltávolított stapes talp alkalmas a humán és a mikrobiális nukleinsavak kimutatására. A stapes talp fejlődéstanilag eltér a temporális csonttól, többi hallócsonttól és a stapes szárától (stapes szuperstruktúra). Az otosclerosis kizárólag az oticus capsula területén fordul elő, amelyhez a stapes talp is tartozik [326].
Kutatási cél
Mikrobiális nukleinsav kimutatás és morfológiai analízis kidolgozása szklerotikus ill. kalcifikált mintákból [327, 328]
Morbillivírus RNS anatómiai lokalizációtól függő kimutatása.[323, 325]
Morbillivírus RNS előfordulása ankyloticus stapes talpminták szövettani eredménye szerint [324]
Betegcsoport. A vizsgálataink első szakaszában 34 műtéti úton eltávolított stapes talpmintát elemeztünk, a kontroll mintákat hat kortikális csont fragmentum és 3 stapes szuperstruktúra alkotta. A műtét előtt végzett audiometria a csontos és a légvezetés között legalább 30 dB különbséget mutatott.
A fagyasztott mintákat steril körülmények között dörzscsészében porítottuk el és RNS-t izoláltunk belőlük [323].
A vizsgálatok második szakaszához a nukleinsav alapú és a morfológiai vizsgálatokra is alkalmas feldolgozás módszerét előrehaladott arterioszklerotikus carotis mintákon dolgoztuk ki. Cadaver eredetű carotis communis-interna-externa érszakaszokkal rendelkező izolált erek feltöltés után fagyasztva lettek 3 mm-es szakaszokra vágva és a vágási felületeken a digitális képfelvételeken a szklerotikus plakk, a lumen és az érfalvastagság alapján értékeltük a folyamat súlyosságát. A jellegzetes plakkot mutató vágási felszíntől elindulva 10 um-s metszetek vágtunk mikrotómmal fagyasztva metszés technikával, amelyekből az irodalmi adatokkal konzisztens módon (kb. 80 %-os arányban) kimutattuk Chlamydophila pneumoniae jelenlétét kétlépcsős PCR amplfikációs eljárással [327, 328].
A vizsgálatok második szakaszában a szintén szklerotikus, kalcifikált stapes fixáció morfológiai és morbillivírus RNS vizsgálatára további 44 eltávolított stapes talpmintát dolgoztunk fel az alábbi módon: 10% formalin fixálás és 0,5M EDTA dekalcifikálás után 15% zselatin blokkba ágyazott mintából 10 um-es fagyasztott metszet sorozat készült a sorozat páratlan tagjai PCR amplifikálásra, a páros tagjai szövettani vizsgálatra kerültek, az értékelést KT és PM szerzőtársak végezték [324]. A
vizsgálatok harmadik szakaszában további 76 mintát gyűjtöttünk és az első szakaszhoz hasonlóan tártuk fel az RNS tartalmat [325].
Reverz transzkripció és cDNS amplifikálás. A homogenizált mintából szilikamembrános módszerrel izolált nukleinsav reverz transzkripcióját és PCR amplifikációját rTth polimerázzal végeztük. Az amplifikációhoz nukleokapszid specifikus primerekkel (MV2, MV3) a 1267 és 1609 nukleotid pozíciók között amplifikáltunk az első körben. A második PCR körben a MV3-MV4 seminested amplifikációban 231 bp terméket, ill. MV2-NP14 szintén seminested amplifikációban 221 bp terméket vártunk. Minden minta alkalmasságát endogén humán RNS amplifikálásával igazoltuk.
Eredmények
A vizsgálatok első szakaszában a 34 stapes talpmintából 20-ban (59%) mutattunk ki morbillivírus RNS-t. Tíz mintából mindkét (MV3-MV4, MV2-NP14) szekvencia amplifkálódott, míg hatból csak az MV3-MV4 szekvencia, négyből csak az MV2-NP14 szekvencia. Ebben a sorozatban kilenc olyan csontmintát vizsgáltunk, amely nem része az oticus capsulának, mind a három stapes szuperstruktúra és mind a hat kortikális csontfragmentum morbillivírus negatívnak bizonyult [323]. Ennek a vizsgálati szakasznak a tapasztalatai alapján a későbbi vizsgálati szakaszokban a műtéti eljárás adta lehetőségek figyelembe vételével a kontroll csontminták számát is sikerült jelentősen emelni. A műtétek közben eltávolított 64 kontroll minta egyikében sem lehetett morbillivírus RNS-t kimutatni, ahogyan a nem otosclerosisos két cadaver stapes talpból sem (23. táblázat). A kontroll minták között nagyobb arányban kortikális csontfragmentumok és stapes szuperstruktúra fordult elő, amelyekben a morbillivírus RNS teljes hiánya szignifikánsan (p<0,001) eltért a 154 stapes talp 64%-os (99/154) morbillivírus RNS prevalenciájától [325].
22. táblázat Morbillivírus RNS előfordulása a stapes fixáció különböző szövettani formáiban morbillivírus RNS
szövettani eredmény MV3-MV4 + MV2-NP14 csak MV3-MV4 csak MV2-NP14
otosclerosis, aktív (n=23) 15 5 3
otosclerosis, inaktív (n=9) 5 1 3
anuláris kalcifikáció (n=8) 0 0 0
osteolysis, hemosziderofágos (n=2) 0 0 0
osteolysis, mononukleáris sejtes (n=2) 0 0 0
A vizsgálatok második szakaszában 44 stapes talpmintában összevetettük a morbillivírus RNS előfordulását a stapes fixáció hátterében álló szövettani folyamattal (22. táblázat). A mintáknak kb. a
fele az otosclerosis aktív, csontátépüléssel jellemezhető fázisában volt, míg az egyötöde az otosclerosis késői inaktív stádiumában volt, amelyben a szklerotikus kötőszöveti állományban gazdag, sejtszegény állomány dominál. A morbillivírus RNS előfordulás igen fajlagos módon, 100%-ban kötődött az otosclerosishoz, míg az egyéb stapes fixációkban nem lehetett kimutatni.
Megbeszélés
A feltárás, a sejtszegénység és a kis mintatérfogat miatt igen kritikus mintatípusban mutattunk ki perzisztáló virális RNS-t. A perzisztens fertőzésekben eleve kis kópiaszámot vártunk, ezért érzékeny kétlépcsős amplifikálással mutattuk ki az RNS-ről átírt cDNS-t. A belső körös amplifikációnál mindkét primerpár jelet adott a pozitív minták 58 %-ában, míg a csak az egyik ill. csak a másik primerpár a 23 ill. 19 %-ában mutatta ki virális RNS-t. Ezen eredmények összhangban vannak a morbillivírus pontatlan replikációjával , magas mutációs rátájával és a defektív virális termékek magas arányával perzisztens fertőzésekben [182]. Ezért a további vizsgálatainkban [324, 325] is mindkét primer párt alkalmaztuk és bármelyik pozitivitása a vírus jelenlétére utalt.
Az első vizsgálati sorozatunkban olyan mintákat dolgoztunk fel, amelyek kivizsgálásánál stapes fixációt valószínűsítettek ill. a műtét során igazoltak. A stapes fixáció hátterében a klinikai adatok alapján otosclerosist lehetett feltételezni ill. stapes fixációt okozó folyamatok ismeretében a minták többségében valóban otosclerosisnak kellett lenni, bár ebben a vizsgálati sorozatban azt nem lehetett megmondani, hogy pontosan melyik mintában volt otosclerosis. Ebből a vizsgálati sorozatból hazai vonatkozásban úttörő, nemzetközi vonatkozásban szintén élenjáró eredményeket jelentett az, hogy a virális RNS-t közvetlenül a csontot érintő gócból lehetett kimutatni a stapes fixációs esetek nagyobb felében és nem lehetett kimutatni a középfül egyéb csontos elemeiből. Az első vizsgálati szakasz eredményei alapján a további tanulmányokban részben az otosclerosis definitív diagnózisát biztosító szövettani vizsgálatot végeztünk [324], részben a műtéti körülményektől függően a középfül megfelelő csontos elemeit kontroll minta minőségben begyűjtöttük [325]. A kontroll csontminták számának növelése igazolta, hogy a középfül egyéb csontos elemeiben (42 kortikális csont, 19 stapes szuperstruktúra, 3 egyéb hallócsont) valóban nem fordul elő morbillivírus RNS, hiába alakult ki a stapes ankylosis, azaz a virális RNS előfordulása az ankylosisos által érintett területre korlátozódott.
A vizsgálatok második szakaszában a definitív szövettani eredménnyel vetettük össze a morbillivírus előfordulását. Mind aktív, mind késői inaktív stádiumú otosclerosisban minden esetben kimutattuk a virális RNS-t, míg az egyéb stapes ankylosisos esetek közül egyben sem. A vizsgálataink során morbillivírus negatív, de szövettanilag nem vizsgált, stapes talpmintákban feltehetően nem otosclerosis okozta a stapes ankylosist, hanem genetikai okok ill. degeneratív folyamatok lehettek a háttérben [193, 329]. Az otosclerosisban a morbillivírus jelenlétén túl a vírusfertőzés gazdaszervezetre kifejtett hatásai is kimutathatók és a vírus patogén szerepének plauzibilitását erősítik. Idetartozó megfigyelések: a vírus perzisztálása az ellenanyag válaszkészség hiányával párosul [330] ill. az
otosclerosisos gócokban a vírus receptorának a CD46-nak sajátos, otosclerosisra jellemző mRNS érési formái jelennek meg [331].
Következtetés
Az morbillivírus RNS jelenléte specifikusan társul az otosclerosis által okozott stapes fixációhoz és csak a megbetegedést okozó gócban fordul elő, a környező, eltérő fejlődéstani eredetű csontokban nem.