A LEC2 és WRI1 transzkripciós faktorok promóter régiójában E2F kötő helyet tudtunk kimutatni, ami alapján feltételezhetően az E2F-ek közvetlenül szabályozzák a kifejeződésüket (16. A ábra; Függelék 33. ábra). Annak érdekében, hogy ezt kiderítsük kromatin-immunprecipitációs (ChIP) kísérletet végeztünk el. Ehhez anti-GFP ellenanyagot használtunk, mintaként pedig a pgE2FA-GFP és pgE2FB-GFP transzgenikus Arabidopsis vonalak érett becőit (S3) használtuk fel (Magyar és mtsai., 2012; Őszi és mtsai., 2020). Az anti-GFP ChIP-et követően az E2FA-GFP becőkben kimutatható volt a kölcsönhatás a LEC2 promóterével, de a WRI1 promóterével már nem. Az E2FB esetében nem detektáltunk kölcsönhatást egyik promóterrel sem (függelék 31. ábra). Az E2FA-GFP kötődése a LEC2 promóteren arra a régióra esett, ahol az E2F kötőhely található (16. B ábra). Eredményeink alapján, az E2FA transzkripciós faktor közvetlenül szabályozhatja a LEC2 gén expresszióját a magfejlődés érési fázisa alatt. Ez az eredmény ugyanakkor nem zárja ki annak a lehetőségét, hogy más E2F faktorok, mint például az E2FC közvetlenül szabályozza az érési fázisban szerepet játszó gének működését, vagy más E2F transzkripciós faktorok a magfejlődés korábbi stádiumában játszanak szabályozó szerepet.
Annak érdekében, hogy még nagyobb bizonyosságot szerezzünk az E2F-ek szerepéről a LEC2 és WRI1 gének szabályozásában a magfejlődés során, elrontottuk a LEC2 és a WRI1 gének promóterében található E2F kötőhelyeket (16. A ábra; Függelék 33. ábra; részletesebben lásd Anyag és Módszerek rész). Transzgenikus riporter vonalakat hoztunk létre az intakt és az E2F-kötésre alkalmatlan, mutáns LEC2 és WRI1 promórekkel, amelyek a fluoreszcens CFP (cián fluoreszcens fehérje) fehérjét expresszálták. Kísérleteinkhez reprezentatív vonalak kerültek kiválasztásra, amelyekről becőmintákat gyűjtöttünk a már korábban leírt módon, a különböző fejlődési állapotok szerint (S1-S4). Kvantitatív PCR (qPCR) reakció segítségével vizsgáltuk meg a riporter vonalakban a CFP expressziót. Az intakt LEC2 riporter vonal (pLEC2-CFP) expressziós mintázata megegyezett az endogén LEC2 gén expressziós mintázatával. A
74 legkorábbi magfejlődési állapotban (S1) szinte alig volt detektálható CFP expresszió, amely aztán az átmeneti állapotban (S2) növekedésnek indult, majd az érési fázisban (S3) elérte maximumát, az érés utáni nyugalmi fázisban pedig lecsökkent (S4). Ezzel ellentétben az E2F kötőhelyben mutáns LEC2 riporter vonal (pmutE2FLEC2-CFP) expressziója szinte végig egyöntetűen magas szintű volt a teljes becőfejlődés során (16. C ábra). A natív WRI1 riporter vonal expressziója a LEC2-höz hasonlóan hűen követte az endogén WRI1 gén expressziós mintázatát és expressziójának maximumát az érési fázisban (S3) érte el. Munkánk során két különböző E2F kötőhely mutáns WRI1 riporter vonal expressziós mintázatát is megvizsgáltuk (pmutE2FWRI1-CFP, 22-es és 24-es vonal). Mindkét riporter vonal becőiben már az érés előtti korai fejlődési állapotokban (S1-S2) expresszálódott, bár a 24-es vonal nagyobb mértékben, mint a 22-es (16. D ábra). A WRI1 riporter vonalak esetében Western-blottal is nyomon követtük a CFP fehérje mennyiségében bekövetkező változásokat a becőfejlődés során (S1-S3; 16. E ábra).
Az intakt WRI1 riporter vonal esetében a CFP nagy mennyiségben halmozódott fel, de kizárólag az érési fázisban, míg a CFP fehérje az E2F-kötésben mutáns WRI1 riporter vonal esetében már a korábbi becőfejlődési stádiumokban is kimutatható volt. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az érési gének működését az E2F transzkripciós faktorok a mag érési fázisára korlátozzák.
75 16. ábra: Az E2F transzrkipciós faktorok szabályozzák a LEC2 és WRI1 gének időbeli kifejeződését a magfejlődés során.
A, A LEC2 és WRI1 gének vázlatos ábrázolása. A p1 és p2 jelölésű nyilak a qPCR során használt primer párok helyét jelölik. A feltételezett E2F kötőhelyeket fehér nyílheggyel jelöltük, távolságukat a start kodontól (ATG) ábrázoltuk. A szürke téglalap a startkodontól felfelé (upstream) 5’ irányban a nem transzlálódó régiót (angolul UTR), míg a startkodontól lefelé (downstream), a 3’ irányban található UTR-t jelöli. A fekete téglalapok az exonokat, míg a téglalapok közötti fekete vonalak az intronokat jelölik. k=kilo bázispár
B, A kromatin immunprecipitációt (ChIP) 6-10 napos zöld, fejlődő becőkből izolált kromatinon végeztük el. A minták a pgE2FA-GFP transzgenikus vonalról származtak, és nyúlban termeltetett anti-GFP ellenanyagot
3’
5’
5’ 3’
76 használtunk. A ChIP-et qRT-PCR analízis követte. Az ábrán a reprezentatív kísérlet eredménye látható három biológiai ismétlésből származó értékekkel. A statisztikai ananlízishez a Mann-Whitney-próbát használtuk. NoAb:
antitest nélküli kontroll minta (Dr. Papdi Csaba munkája alapján).
C-D, Az intakt (pLEC2-CFP; pWRI1-CFP) és E2F kötőhely mutáns promóterekkel (pmutE2FLEC2-CFP;
pmutE2FWRI1-CFP) rendelkező LEC2 (C) és WRI1 (D) riporterek expresszióját a különböző becőfejlődési állapotokban (S1-4) qRT-PCR analízissel állapítottuk meg. Az L22 és L24 jelölés két független E2F kötőhely mutáns promóter vonalat jelent (D).
A relatív transzkript mennyiségek az intakt promóterrel rendelkező konstrukció S1 stádiumú becőmintájának expressziós szintjéhez normalizálva lettek megadva. A feltüntetett szórás három biológiai ismétlésből származó értékekre vonatkozik. P≤0,05(*), 0,01(**) szignifikáns különbségnek csak az adott becőstádiumon belül, az intakt és mutáns promóterrel rendelkező konstrukciók mintái között fogadtuk el. ns: nem szignifikáns különbség.
E, A CFP fehérje szintet Western blot segítségével követtük nyomon a becőfejlődés során (S1-S3) a D, pont transzgenikus vonalaiban. A vizsgálathoz anti-GFP ellenanyagot használtunk. A CFP fehérje molekulasúlyát (28 kDa) az ábra bal oldalán tüntettük fel. A különböző fejlettségi állapotú becő minták fehérjéit Coomassie festésével tettük láthatóvá a membránon.
A LEC2 riporter vonallal ellentétben a WRI1 riporter vonalakban a CFP jel elég erős volt ahhoz, hogy a fejlődő embriókban konfokális lézer scanning mikroszkóp alatt is detektálhassuk.
Korábbi eredményeinket megerősítette, hogy a WRI1 riporter vonal CFP jelét a szív állapotú embrióban nehezen lehetett detektálni. A legerősebb CFP jelet az érési fázisban, a korai torpedó embrió állapotban láttuk, majd fokozatosan gyengült az érés során, és teljesen lecsökkent az érett embrióban. Ezzel ellentétben mindkét az E2F kötőhelyben mutáns WRI1 riporter vonalban erős CFP jelet detektáltunk már a szív állapotú embrióban, a jel erőssége pedig fennmaradt egészen a késői torpedó embrió állapotig (17. A,B ábra, Függelék 32. ábra). Megfigyeltük, hogy míg az intakt WRI1 riporter vonal esetében a CFP jel a teljes embrióban detektálható volt, addig az E2F kötőhelyben mutáns WRI1 riporter vonalnál a CFP jel hiányzott az éretlen embriók gyökércsúcsából (17. C ábra). Ez alapján az E2F transzkripciós faktorok nem csak időben, hanem térben is szabályozzák a WRI1 expresszióját az embriófejlődés során.
77 17. ábra: A WRI1 transzrkipciós faktor embrió-specifikus megjelenését az E2F transzkripcionális szabályozók kontrollálják.
A-B, Éretlen magokból izolált fejlődő embriókról konfokális lézer scenning mikroszkóppal készült reprezentatív képek, melyek az intakt (A) és E2F kötőhelyben mutáns (B) WRI1 promótereket tartalmazzák (pWRI1-CFP és pmutE2FWRI1-CFP riporter vonalak).
C, Középidei torpedó állapotú embrió embrionális gyökércsúcs régióját fehér szaggatott vonallal jelöltük az A, és B, ábrákon, melyek a C, ábrán kinagyítva láthatóak.
A CFP jel kék színnel látható. Az embriókról készült ábrák tartalmazzák a méretskálát.
78