1. Az aktivátor típusú E2F transzkripciós faktorok szerepe a fejlődő embrióban
1.3. Az aktivátor típusú E2F transzkripciós faktorok a mag fejlődési fázisától függően represszorként
Korábbi eredmények alapján a LEC gének (LEC1-2) funkcióvesztéses mutációja csökkenti a tartaléktápanyagok felhalmozódását (Braybrook és Harada, 2008). Eredményeink alapján mindkét LEC gén (LEC1-2) idő előtt bekapcsolódik az e2fa-2/e2fb-1 dupla mutánsban (15. B ábra). Kimutattuk azt is, hogy a LEC2 gént az E2FA TF közvetlenül is szabályozhatja az érési fázis során, mégpedig a promóterében található E2F kötőhelyen keresztül (16. B ábra). A LEC2 expressziója az e2fb-1 mutánsban ugyanakkor már az érési fázist megelőzően aktiválódott, jelezve, hogy az E2FB transzkripciós faktor korábban szabályozza a LEC2-t, mint az E2FA (15.
B ábra). Amikor a LEC2 promóterében az E2F kötőhelyet rontottuk el, a LEC2 expressziója már a legelső becőmintában (S1), a morfogenezis során aktiválódott, ami tovább erősíti azt a képet, hogy az E2F transzkripciós faktorok együttesen megakadályozzák a LEC2 idő előtti működését.
Egy másik potenciális E2F célgén, a WRI1 a LEC2 génhez hasonlóan idő előtt aktiválódott, amikor elrontottuk a promóterében található E2F-kötő szekvenciát (16. C,D,E). Mindezek alapján, az E2F-ek a magérési gének negatív szabályozói, de nem csak a fejlődési fázisra specifikusan korlátozzák azok működését (azaz nem engedik bekapcsolódni őket az osztódó embrióban), hanem a mag érési fázisa során is képesek befolyásolni az expressziós szintjüket (mintegy beállítják, finoman hangolják az expressziójukat – 26. ábra). Az Arabidopsis rbr co-suppression mutáns vonal (csRBR, ahol túltermeltetett RBR valamilyen ismeretlen mechanizmuson keresztül gátolta a saját és az endogén RBR kifejeződését) fiatal csíranövényeiben az embrionális érési gének, többek között a LEC2 és az ABI3 továbbra is aktívak maradnak, jelezve, hogy az RBR szabályozza ezeket a géneket a poszt-embrionális fejlődés során (Gutzat és mtsai., 2011). A poszt-embrionális növényekben ezek a gének a
98 Polycomb Group (PcG) szabályozása alatt állnak (Yang és mtsai., 2013). Ezek az evolúciósan konzerválódott több komponensű fehérje komplexek növényekben is megtalálhatóak. Vajon az E2F-ek és az RBR közvetlenül részt vesznek a PcG működésében, vagy közvetve szabályozzák a PcG funkcióját, esetleg egy párhuzamosan működő szabályozásról van szó? Ezekre a kérdésekre a válasz egyelőre nem ismert. Az eredményeink azonban tovább erősítik azt a nézetet, hogy az E2F-ek fontos szerepet játszanak a fejlődési átmenetekben.
Eredményeink alapján a mag fő tartalék fehérjéi, a 12S globulin és a 2S albumin idő előtt, már a magfejlődés morfogénikus fázisában (S1) felhalmozódnak, bár az e2fa-2, az e2fb-1 és az e2fa-2/e2fb-1 dupla mutáns vonalakban különböző mértékben. Legerősebben az e2fa-2 és az e2fa-2/e2fb-1 dupla mutánsokban, és gyengébben az e2fb-1 mutánsban (19. ábra). Érdekes módon, ebben a korai időpontban a mag érését szabályozó AFL gének egyike sem aktiválódott az e2fa és e2fb mutánsokban, jelezve, hogy az e2f mutánsokban nem az AFL géneknek tulajdonítható a tartalék fehérjék idő előtti felhalmozása (15. A). Korábbi eredményeink alapján az E2FA az RBR-rel represszor komplexbe lépve megakadályozza a levélfejlődés során a mitózis és az endociklus (a differenciálódó sejtekre jellemző módosult sejtciklus, ahol csak az S-fázis ismétlődik) közötti átmenetet (Magyar és mtsai., 2012). Ez arra enged következtetni, hogy az E2FA az RBR-rel komplexben fejlődési átmeneteket szabályoz. Amikor az E2FA és a DPA dimerizációs partner egyidejűleg lett túltermeltetve, a differenciálódás gátolódását lehetett a korai csíranövény fejlődése során megfigyelni (DeVeylder és mtsai., 2002; Kosugi és Ohashi, 2003). Hasonló kísérletben, egy olyan E2FA mutánst termeltettek túl a DPA-val, amelyik sem transzaktiválásra sem RBR kötésre nem volt képes. Ebben a mutáns növényben az endociklus jóval korábban kapcsolódott be a kontroll növényekhez képest, és a sejtek DNS tartalma (ploidy szint) lényegesen megnőtt (Magyar és mtsai., 2012). Meglepő módon a transzaktivációs képesség hiányában is a sejtciklus szabályozási gének korai működését lehetett megfigyelni (pl.
Ccs52A1-2), ami arra engedett következtetni, hogy ezek a gének a levél fejlődése során a gátolódás alól szabadultak fel (ún. de-represszió - Magyar és mtsai., 2012). Az E2FA tehát potenciálisan represszorként funkcionálhat a magérési program átmeneti szakaszának szabályozásában is, jelezve, hogy az E2FA gátló szerepe nemcsak a kicsírázott növényekre korlátozódik. Azt, hogy az E2FA ezt a gátló szerepét vajon az embrióban is az RBR-rel komplexben végzi-e el még nem tudjuk. Ugyanakkor, mind az E2FA, mind az RBR fehérje a magfejlődés morfogénikus szakaszában halmozódik fel a legnagyobb mértékben, amely támogatja azt a hipotézist, miszerint a magfejlődés korai szakaszában gátló komplexet hozhatnak létre (10. ábra). Érdekes, hogy az SSP fehérjék felhalmozódása kisebb mértékű volt az e2fa-1 és az e2fb-1 mutánsokban az e2fa-2 mutánssal összehasonlítva és egyáltalán nem volt
99 megfigyelhető az e2fb-2 mutánsban (19. ábra). Az e2fa-1 és az e2fb-1 mutánsok esetében megközelítően hasonló csonka E2F fehérjék jöhettek létre, amelyek még bizonyos funkciókat megőrizhettek (dimerizációs képesség, DNS-kötődés), míg másokat elveszíthettek (transzaktiválás, RBR-kötés). Feltételezzük, hogy a T-DNS inszerció különböző, funkcióvesztéses fehérje mutánsokat hozhatott létre ezekben a mutáns vonalakban: az az e2f mutáns, amelyik elveszítette a dimerizációs képességét (e2fb-2) nem volt képes stimulálni a tartalék fehérjék idő előtti felhalmozódását. Ezzel szemben, az az e2f mutáns (e2fa-2) indukálta legerősebben a tartalék fehérjék korai felhalmozódását, amelyik potenciálisan a legjobban képes dimerizálni a DP faktorokkal (DPA-B) és ennek következtében a legerősebben kötődhet a célgénekhez. Kísérletesen még igazolásra vár, hogy ezek a csonka proteinek valóban nem képesek kötni az RBR fehérjét és transzaktiválni sem tudnak, így a fő különbséget köztük a DNS kötő képességük jelenti. Lehetséges, hogy a csonka E2FA mutáns fehérjetermék elfoglalja a DNS kötő helyet és megakadályozza más gátló komplexek kialakulását (mint, amilyenek például bizonyos DEL fehérjék is).
26. ábra: Az aktivátor E2F-ek feladatát a mag és az embriófejlődés során bemutató modell.
A mag és embriófejlődést két egymást követő, ellentétesen szabályozott folyamat határozza meg. Az első az osztódási fázis, melynek során létrejönnek az embrióra jellemző szervek és szövetek (morfogenezis), a második a mag érési fázisa, amely során megtörténik a differenciálódás és fő eseménye a tartaléktápanyagok felhalmozódása (zöld és fekete háromszögek). Az aktivátor E2F-ek feladata a morfogenezis során a sejtciklus szabályozó gének teljes mértékű aktiválása, míg az érési fázisban a magnyugalmi állapot megteremtése a sejtosztódás gátlásán keresztül, feltehetően az E2FC-vel együtt és az RBR-el komplexet alkotva. Az aktivátor E2F-ek gátolják a morfogenezis során a mag érési programját. Megakadályozzák a mag érési gének, mint a LEC2 és a mag tartalék fehérjéinek, mint a 2S albumin és a 12S globulin idő előtti felhalmozódását. A magfejlődés differenciálódási fázisa során pedig finoman hangolják a mag érési gének kifejeződését és ebben a szabályozási folyamatban feltehetően az E2FC és az RBR is részt vesz.
100