A LEC2 kifejeződése kizárólagosan, míg a WRI1 expressziója dominánsan az embriófejlődésre korlátozódik, de gyengébben a gyökérben is detektálták (eFP browser – Winter és mtsai., 2007). A legújabb eredmények alapján azonban a LEC2 is szerepet játszik a gyökérfejlődésben (Tang és mtsai., 2017). Kíváncsiak voltunk, vajon a riporter vonalaink segítségével ki tudjuk-e mutatni a LEC2 és a WRI1 expresszióját a gyökérben is. Fiatal, egy hetes transzgenikus csíranövények gyökerét vizsgáltuk meg konfokális lézer scanning mikroszkóp segítségével (18. ábra). Az intakt LEC2 riporter vonal (pLEC2-CFP) CFP jele a gyökér őssejt régiójában jellegzetes mintázatot mutatott. Expressziója a proximális gyökérmerisztémán belül az epidermisz és kortex sejtekben volt megfigyelhető. A legerősebb CFP jelet közvetlenül a QC (quiescent centre: nyugvó centrum) melletti kortex, endodermisz és epidermisz iniciális sejtekben detektáltuk, majd a fluoreszcens jel, a hajtás irányában felfelé gyengült és néhány sejttel távolabb a QC sejtektől már gyakorlatilag kimutathatatlan volt. Az E2F kötőhelyben mutáns LEC2 riporter (pmutE2FLEC2-CFP) esetében sokkal gyengébb jelet detektáltunk, elsősorban közvetlenül a QC melletti iniciálisokban (18. A,B ábra). Több párhuzamos E2F-kötésben mutáns vonalban is hasonlóan gyengébb jelet detektáltunk a kontrollhoz képest, ami alapján úgy véljük, hogy az E2F-ek a LEC2 gén működésében ellentétes szerepet játszanak a gyökérben (aktivátor funkció) és az embrióban (represzor funkció). A natív WRI1 riporter legerősebb CFP jelet közvetlenül a QC melletti sejtekben, az ún. iniciálisokban mutatta, valamint a szállító szövet floém (háncs) sejtjeiben, de kizárólag a gyökér merisztéma központi részében (18. C ábra). Az intakt WRI1 riporter vonalhoz képest az E2F-kötő szekvenciában mutáns WRI1 riporter vonalunk gyökerében látványosan erősebb CFP jelet detektáltunk mind a QC körüli sejtekben, mind pedig a szállítószövet sejtjeiben és ez megmaradt a központi merisztematikus sejtektől a hajtás irányába távolodva is (18. D ábra). Korábbi eredmények alapján a WRI1 expressziója cukorral indukálható, ezért megemeltük a csírázási médium cukortartalmát 1 %-ról 3 %-ra és ilyen körülmények között növesztettük őket függőleges lemezeken (Masaki és mtsai., 2005). Megállapíthattuk, hogy az intakt WRI1-riporter valóban mutat némi cukor indukciót a gyökérben, amit a mutáns promóter esetében már nem láttunk. Mivel a WRI1 riporter expressziója a gyökérmerisztémán belül főként a QC körül jelent meg, és az auxinnak fontos szerepe van a gyökérmerisztéma fenntartásában, auxin tartalmú (10 mM IAA) függőleges lemezeken is növesztettünk WRI1 riportereket tartalmazó növényeket (Benett and Scheres, 2010). Az auxin kezelés a natív promóteres változatnál a CFP jel erősödését eredményezte
79 elsősorban a háncsrészben és a merisztémától távolodva, míg a mutáns promóteres konstrukcióval rendelkező növények gyökerében nem okozott változást a nem kezelt, kontroll gyökerekhez képest (18. C,D ábra). Eredményeink alapján igazoltuk, hogy mind a LEC2, mind pedig a WRI1 promóter expresszálódik a gyökérben, és megmutattuk, hogy mindkét embrionális gén legerősebben az ún. őssejt régióban fejeződik ki, a QC körüli sejtekben és a merisztémában.
Megállapíthattuk, hogy mindkét gén gyökérbeli működését szabályozhatják az E2F transzkripciós faktorok. A WRI1 esetében az embrionális fejlődéshez hasonló módon ez a szabályozás korlátozza a gén kifejeződését. Ezzel ellentétben a LEC2 működésében az E2F szerepe megváltozott a gyökérben az embrióhoz képest; amíg az embrióban gátolta, a gyökérben stimulálta a LEC2 kifejeződését. Mindez arra enged következtetni, hogy az E2F szabályozás egy adott gén esetében szövet és fejlődés specifikus módon megváltozhat.
80 18. ábra: A LEC2 és a WRI1 riporter vonalak gyökér-specifikus kifejeződése az E2F transzkripciós faktoroktól függ.
A-B, Fiatal (egy hetes) csíranövények gyökeréről konfokális lézer scanning mikroszkóp segítségével készült reprezentatív képek, melyek az intakt és az E2F kötőhelyben mutáns riporter vonalakkal készültek (pLEC2-CFP, pmutE2FLEC2-CFP). A CFP jel kék színnel, a sejtfalak PI festése piros színnel látható. Az egyesített képeken a PI (piros) festés a CFP (kék) jellel együtt látható.
C-D, Fiatal (egy hetes) csíranövények gyökeréről konfokális lézer scanning mikroszkóp segítségével készült reprezentatív képek, melyek az intakt és E2F kötőhelyben mutáns riporter vonalakkal készültek (pWRI1-CFP, pmutE2FWRI1-CFP). A csíranövényeket 1 % vagy 3 % cukortartalmú vagy 10 nM IAA (indol-ecetsav; auxin) tartalmú függőleges lemezen növesztettük. A piros nyíl a gyökérben található Ph: a floém szállítószövetet jelöli. A
81 kulcsfontosságú magérési gének expresszióját a mag és becőfejlődés során. Ezek az eredmények arra ösztönözték munkacsoportunkat, hogy megvizsgáljuk vajon ezek az aktivátor E2F transzkripciós faktorok közvetlenül szabályozni tudják-e magát a magérési programot. Az Arabidopsis magok száraz súlyának egyharmadát kétfajta tartalék fehérje teszi ki, nevezetesen a 12S globulin és a 2S albumin (ezek angolul a seed storage proteins röviden SSP; Baud és mtsai., 2002). Az aktivátor E2F-ek szerepének tanulmányozásához, specifikus ellenanyagok segítségével meghatároztuk a 2S albumin és a 12S globulin fehérjék mennyiségét Western-blot kísérletben a magfejlődés során mind a szimpla (e2fa-2, e2fb-1), mind pedig a dupla (e2fa-2/e2fb-1) e2f mutánsokban. Korábbi eredményekhez hasonlóan ezek az SSP fehérjék vad típusú becők esetében kizárólag az érési fázisban (S3) halmozódtak fel (Vicente-Carbajosa és Carbonero 2005; 19. ábra). Ezzel ellentétben az e2f mutánsokban már az S1 becőfejlődési állapotban megjelentek. Az e2fa-2 szimpla és e2fa-2/e2fb-1 dupla mutánsokban jelentősen, míg az e2fb-1 szimpla mutánsban csak kisebb mértékben nőtt meg a mennyiségük (19. A ábra). A különbség az E2FA és E2FB mutánsok között arra engedett következtetni, hogy a két aktivátor E2F szerepe a tartalék fehérjék szabályozásában eltérhet egymástól. Ugyanakkor, azt is elképzelhetőnek tartottuk, hogy ezek az e2f mutánsok a T-DNS (transzfer-DNS) beépülését követően eltérő képességű mutáns fehérjékkel rendelkeznek (ezek az ún. funkcióvesztéses mutánsok) és az SSP-ék indukálódása elsősorban attól függ, hogy a különböző mutánsokban E2F-DP közötti kapcsolódás elengedhetetlen követelménye annak, hogy az E2F transzkripciós