Az E2F transzrkipciós faktorok jellemzése

2002-ben Vandepoele és mtsai. Arabidopsis thalianaban az E2F családnak 6 tagját írták le. Ezek közül három, az E2FA, E2FB és az E2FC strukturális felépítése megegyezik az állati E2F1-5 fehérjék szerkezetével. Két, az E2F-ekkel rokon DIMERIZÁCIÓS PARTNER, DPA és DPB képes az E2FA-C faktorokkal heterodimert formálni (Magyar és mtsai., 2000). A három másik Arabidopsis E2F TF csak távoli rokonságban áll a többivel, ezeket DP-E2F-szerű, röviden

32 DEL fehérjéknek (DP-E2F-Like) DEL1, DEL2 és DEL3 nevezték el. A DEL fehérjék DNS-kötő doménje az E2F-DP faktorokhoz hasonló, de szemben velük, kettővel is rendelkeznek, míg a DP-kel nem hoznak létre heterodimert, ennélkül is képesek a DNS-hez kötődni. Funkciójuk közvetlenül nem függ az RBR fehérjétől, mivel nem rendelkeznek RB-kötő motívummal (7.

ábra).

7. ábra: Arabidopsis E2F és DP rokon fehérjék szerkezete.

Az Arabidopsis E2FA, E2FB, és E2FC fehérjék rendelkeznek a klasszikus E2F molekulákra jellemző összes konzervált doménnel (DNS-kötő, Dimerizációs, Marked box, Transzaktivációs és RBR-kötő domén). Az Arabidopsis E2F család másik három tagja, a DEL1-3/E2FE-F fehérjék csak a konzervált DNS-kötő doménnel rendelkeznek, de ebből kettővel is, míg a többi strukturális E2F-re jellemző domén hiányzik belőlük. A DIMERIZÁCIÓS PARTNER (DPA és DPB) fehérjék szerkezete a klasszikus E2F transzkripciós faktorokhoz hasonló. Csillaggal jelöltük a potenciális CDK foszforilációs helyeket (Magyar és mtsai., 2008 alapján).

Az állatoknál létrehozott rendszerhez hasonlóan a növényi E2F-ek funkcionális jellemzése alapján transzkripciós aktivátor (E2FA és E2FB) illetve transzkripciós represszor (E2FC) csoportokba sorolhatóak be (Magyar és mtsai., 2008). Funkcionális jellemzésük során további különbségeket találtak az egyes Arabidopsis E2F-ek között. Míg az E2FA túltermeltetése nem csak a mitótikus sejtciklus, hanem az endociklus aktivációját is eredményezte (De Veylder és mtsai., 2002; Kosugi és Ohashi, 2003), addig az E2FB esetében

33 csak a mitózis aktiválódott (az endociklus ugyanakkor gátolódott). Az endociklus a mitótikus sejtciklus egy módosított változata, ahol csak a DNS replikációs fázis ismétlődik, aminek következtében megnő a sejtek DNS tartalma (ploidy-szint). A növényi endociklus az M-fázisú CDKB1;1 inaktivációjával és ciklin partnerük (mitótikus CYCA2;3) lebomlásával kezdődik (Boudolf és mtsai., 2009). A ploidy-szint emelkedése a differenciált és megnyúlt növényi sejtekre jellemző. Az E2FB túltermeltetése fokozta a sejtosztódást és gátolta az endociklust mind növényi sejtekben, mind pedig transzgenikus Arabidopsis növényekben (Magyar és mtsai., 2005;

Sozzani és mtsai., 2006). Az E2FC esetében pedig megállapították, hogy míg a mitózist negatívan, addig az endociklust pozitívan szabályozza (del Pozo és mtsai., 2006). Ezek alapján az E2FB és az E2FC antagonisztikus funkciójú TF-ok (6. ábra). Az E2FA pedig mind a sejtosztódást, mind az endociklust képes pozitívan szabályozni (del Pozo és mtsai., 2006;

Sozzani és mtsai., 2006).

Az E2FA fehérje az E2F szabályozási hálózat egy speciális tagja. Promóterében nincs konszenzus E2F-szabályozó szekvencia elem, ezáltal működését feltételezhetően egyik E2F transzkripciós faktor sem irányítja közvetlenül, ugyanakkor ő maga szabályozza az E2FB és az E2FC rokon gének kifejeződését is (Vandepoele és mtsai., 2005). Érdekes módon, az E2FA-DPA heterodimer túltermeltetésével nemcsak a sejtosztódás, hanem az endociklus is aktiválódott, amely a differenciálódó sejtekre jellemző folyamat. Az egyik hipotézis szerint, ezekben a növényekben az E2FA túltermeltetésével az RBR nem tud lépést tartani, és az így szabaddá váló, RBR-mentes E2FA stimulálja az S-fázisba lépést (DeVeylder és mtsai., 2002).

Az osztódó sejtekben az aktív E2FA további osztódásokat stimulál, mert ezek rendelkeznek a mitózist indukáló faktorral (Mitosis-Inducing Factor (MIF), az állati Mitosis-Promoting Factor (MPF) növényi megfelelője). A nem osztódó sejtekben azonban, ahol MIF már nem képződik, az E2FA csak az endociklust képes aktiválni (G1-S ciklus), aminek köszönhetően megnő a sejtek DNS tartalma (ploidy szintje). Érdekes módon azonban az endociklust egy olyan E2FA deléciós mutáns is képes volt stimulálni, amelynek hiányzott a transzaktivációs doménje (Magyar és mtsai., 2012). Kimutatták azt is, hogy az E2FA az osztódó sejtekben komplexben van az RBR-vel, és így közösen gátolhatják a mitózisba lépést megakadályozó géneket (mint például az APC aktivátorát, a Ccs52A1-2 géneket; Magyar és mtsai., 2012). Ezt támasztotta alá, hogy az RBR fehérje kötődését ezeknek a géneknek a promóter régiójában ki lehetett mutatni (Magyar és mtsai., 2012). Az RBR funkció gátlásával spontán sejthalált lehetett megfigyelni az Arabidopsis gyökerek merisztémájában (Cruz-Ramirez és mtsai., 2013). Későbbi vizsgálatok alapján kiderítették, hogy az RBR specifikusan az E2FA-val komplexben szabályozza a sejthalál folyamatát (Horváth és mtsai., 2017).

34 Az E2FB TF túltermeltetése mind növényi sejtkultúrában, mind pedig növényekben a sejtosztódási gének aktiválódásához vezetett, ezért sorolták az E2FA-val együtt az aktivátor E2F-ek közé (Magyar és mtsai., 2005; Sozzani és mtsai., 2006). Az E2FB túltermeltetése növényi sejtekben (dohány Bright Yellow 2 sejtek, röviden BY-2 sejtek) a növényi növekedési hormon, az auxin hiányában is képesnek bizonyult a sejtosztódást aktiválni, ami az állati aktivátor E2F-ekhez teszi hasonlatossá (Magyar és mtsai., 2005). Az E2FB, az S-fázis specifikus E2FA-val szemben, a sejtciklus teljes hossza során kifejeződik (Magyar és mtsai., 2000; 2005).

Az E2FB túltermelése az Arabidopsis sejteinek számfeletti osztódásához vezet, gátolja a sejtek megnyúlását, a növények gyökerei pedig rövidebbek lettek a kontroll vad típusú gyökerekhez viszonyítva (Sozzani és mtsai., 2006). Érdekes módon az Arabidospsis E2FB paradicsomban történő túltermeltetése korai virágzáshoz vezetett és fokozta a terméshozamot, és a termések méretét is (Abraham és del Pozo, 20012). Az E2FB az E2FA-hoz hasonlóan csak a foszforilálatlan RBR fehérjével lép komplexbe, és mindkét fehérje képes dimerizálni a DPA-B fehérjékkel (Magyar és mtsai., 2000, 2005, 2012; Őszi és mtsai., 2020). Az egyik feltételezett célgén a G2/M fázisátmenetet szabályozó CDKB1;1, melynek fokozott kifejeződését lehetett megfigyelni az E2FB túltermeltetett növényi sejtekben (Magyar és mtsai., 2005; Henriques és mtsai., 2010; Henriques és mtsai., 2013).

Az E2FC túltermeltetése gátolta az S-fázis specifikus CDC6 gén kifejeződését, ezért transzkripcionális represszor funkciót tulajdonítottak neki (del Pozo és mtsai., 2002). Ezt a feltételezést tovább erősítette, hogy az E2FC RNS interferencián alapuló csendesítésével már differenciálodó levelekben sejtciklus gének re-aktivációját lehetett megfigyelni, (pl. a Ciklin B csaknem százorosra nőtt expressziója, del Pozo és mtsai., 2006). Nem csak a mitózis gátlásában, hanem az endociklus elősegítésében is részt vesz (del Pozo és mtsai., 2006). Az E2FC fehérjéről is igazolták, hogy képes komplexbe lépni az RBR fehérjével. Protoplaszt transzfekciós kísérletekben az E2FC elsősorban a DPB-vel alkot dimert (Kosugi és Ohashi, 2002). Csoportunk nem közölt eredményei alapján az E2FC a DPA-val is képes heterodimerizálódni, de a levélfejlődés során elsősorban E2FC-DPB komplex a domináns formája, csíranövényeken végzett fehérjekomplex tömegspektrometriás analizíse azonban mind a két DP faktort kimutatta, mint E2FC kölcsönható (Pettkó-Szandtner nem közölt eredményei alapján). Egy másik tanulmány során kimutatták, hogy az E2FC és az E2FB egymással ellentétes hatást fejt ki a távoli E2F rokon DEL1 gén kifejeződésére; az E2FB aktiválja, míg az E2FC represszálja. A DEL1 gén túltermeltetése gátolta, míg hiányában csökkent a ploidy szint (Berckmans és mtsai., 2011). Kimutatták, hogy az E2FC fehérje mennyisége sötétben nő meg, míg fényben lebomlik az ubikvitin-SCF útvonalon keresztül (del Pozo és mtsai., 2002; López és mtsai., 2008). Az E2FC

35 szerepet játszik a másodlagos sejtfalszintézis szabályozásában (lignin, cellulóz, hemicellulóz), ahol transzkripciós aktivátor és represszor funkciót egyaránt betölt (Taylor-Teeples és mtsai., 2015).

Az E2FB-E2FC arányt az auxin szint szabályozza (del Pozo és mtsai., 2002; Magyar és mtsai., 2005). Az auxin dózis-függően szabályozza a növekedést; alacsony auxin szint sejtmegnyúláshoz, míg magas auxin szint a megnyúlás gátlásához vezet. A magas auxin koncentráció egyben az őssejtállapot fentartásában és az osztódási képesség megőrzésében is fontos szerepet játszik (Scheres és Xu, 2006). Az E2FB és az E2FC fehérjék stabilitását az auxin ellentétesen szabályozza. Az E2FA auxin általi aktivációja fontos szerepet tölt be a mellékgyökér képződés során lezajló aszimmetrikus osztódás aktiválásában (Berckmans és mtsai., 2011b).