fejlesztett több, a melanomában jelenlévő aktivált mutációk által hiperaktívvá váló fehérjék célzott gyógyszeres kezelése.
A kutatás újszerűsége
A melanomák 40-60%-ára jellemző a BRAF gén mutációja. A leggyakoribb pont mutáció a 600-as kodonban egy valin-glutaminsav cserét eredményez (BRAF vGooE), ami által a képződő szerin-treonin kináz folyamatosan aktív lesz, ezáltal elősegíti a tumor növekedését, invazivitását és túlélését a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) szignalizációs útvonalon keresztül. Egy másik melanomára jellegzetes aktiváló mutáció a MAPK szignalizációs útvonal egy másik molekulájának, az NRAS (15-20%) gén Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága (FDA) 2011-ben engedélyezte [15]. Kezdetben elért sikereket azonban jelentősen beárnyékolja a viszonylag rövid időn
belül (tv? hónap) kialakuló gyógyszer-rezisztencia [16, 17]. A rezisztencia hátterében álló molekuláris mechanizmus/ok, azonban még felderítésre várnak.
Vizsgálataink célja
Vizsgálataink során célunk a preklinikai fázisban lévő vemurafenib analóg, a PLX4720 [18, 19] hatásának vizsgálatát BRAF vGooE mutáns, NRAS QGlL/R mutáns és NRAS vad típusú melanoma sejtvonalakon. Annak ellenére, hogy a PLX4720 szelektív BRAF vGooE
inhibitor, mégis fontosnak tartjuk hatásának vizsgálatát különböző NRAS mutációt tartalmazó sejtvonalakon is, mert egyrészt ugyanabban a szignalizációs útvonalban játszanak szerepet, másrészt a vemurafenib esetében a mutáns NRAS QGlL/R gént hordozó sejtvonalaknál gátló hatás helyett fokozott sejtszaporodást figyeltek meg félhatásos gátló koncentrációnál. Emellett célunk még a mutáns BRAF v600E, NRAS Q6lL/R gént hordozó sejtvonalakból rezisztens sejtvonalak létrehozása, annak érdekében, hogy a rezisztencia kialakulását kísérő genomikai változásokat RNS, DNS és fehérje szinten tanulmányozni tudjuk. Vizsgálataink további célja a rezisztens sejtvonalak esetlegesen megváltozó invazivitásának tanulmányozása, valamint a rezisztens sejtvonalak in vivo állat modell rendszerben történő vizsgálata, és különböző őssejt markerek expressziójának meghatározása a rezisztens sejtvonalakon.
Az eddigi fontosabb eredmények bemutatása
Eddigi eredményeiink szerint a PLX4720 félhatásos gátló koncentrációban jelentősen
gátolja a két BRAF vGooE mutáns sejtvonalban (WM983A, WM983B) a sejtek szaporodását.
Ebben a koncentrációban (analógjához a vemurafenibhez hasonlóan) kis mértékben növelte a két mutáns NRAS QGll/R sejtvonal (WM1361A, WM1366) proliferációját, míg a mind két génre nézve vad típusú sejtvonal (WM3211) proliferációjára nem volt hatással.
A BRAF v6ooE mutáns, rezisztens WM983A, WM983B sejtvonalak létrehozásához a PLX4720 félhatásos gátló koncentrációjának tízszeresét tartalmazó tápoldatban tenyésztettem a sejteket. Rezisztens sejtvonalaknak a kezelést túlélő, jól osztódó sejteket neveztem el (WM983Arez, WM983Brez); ez körülbelül tv50 nap kezelést igényelt.
Nemzeti Fejlesztési www.ujszechenyiterv.gov.hu Ogynökseg
l
-06 "0 638 638
-' SZÉCHENYI TERV
Molekuláris eltérések elemzése PLX4720 rezisztens melanoma sejtvonalakban Globális génexpressziós vizsgálatok eredménye
(Affymetrix gén expressziós array).
A WM983A, WM983B és WM983A REZ Cl (rezisztens) és WM983B REZ (rezisztens) RNS expressziós array eredményei szerint a rezisztens törzsekben az anyai sejtvonalakhoz képest 1878 gén mutat csökkent és 368 gén mutat meg növekedett expressziót.
A mellékelt dendogrammon jól látszik a sejtvonalak expressz10s mintázatá-nak elkülönülése, valamint a heatmap-en a csökkent (piros színnel jelölve) illetve megnövekedett expressziójú (zöld színnel jelölve) gének csoportja.
Volcano Piot-on analizis eredmélnyét az alábbi ábra foglalja össze.
A legnagyobb expressziét a CCL-2 gén mutatta, míg a leginkább alulexpresszálódott gén a PMEL gén volt .
' SZÉCHENYI TERV
Népegészségügyi Képző és Kutatóhelyek Egyesületének VIII. Konferenciája Kaposvár drug resistan<e in mtlanom,, <ell lines
E~s,ro1 SZJL\"t.\ ~
lntroducllon: l>IK<-sene-Jlte•:l~d therorr is t>ne üf
th~ Jl}<) l rrl•nH~in~ JppfL-..I(hl Ji..·.r rJtklltS ~\it h Ut1·
rc;e('tohle •'fm~tastati.: mt'Lmvm.1 \"emurllfl"luh t'
Pl.X-r ~o:•. ~ highl:: selecti,·einhil>itvr ,., tlk muh•lt BR.;~\·
n()I)E onct•~ene has heen rewlll)' Jrp~<n·eJ t<)· FDA wi th limit.ltkmsJll(l hl earl~· Jrug r~.·.)i~t.lllú'. Etfl2'"·u·.-~
Jl"f'f'JJchc-$ If"~ uv~rl."c•mt· the J.ru~ töl t.UK~; ;,ut
ur-~t>ntl:; n~~:Yd.cd in N da-tr. .:ur e th h Jead~· Ji;:,t~+.ht·'
Matherl.>l< .md methoJs: lhe~im ef r-ur<tuJ~·" u t.•
Jl·\·~lt•p .1nJ .:h.unltc-riu PI.X--l~ 21.1 reshtJnt 1\l•:bnu-mJ (eU l int.>-~.m~l m~J~ur.e th t' gn·\,1h inhihih.·rycn~xt vfPLX-4~~11C·Il BRAFmut.'NR,;.~\IT;W~N.I' \,1\'~1
~ .lll!. DR.'IFWT!~RA~\I"f •:ll'hl~~ll), JnJ
llRAF-\IT:'NR.;$mut 0\'MLl<-li htUI .. m md.1nomacell lilk .;ner ,le,·d··ring the 1 si>tMt \\'hl'i JSces .!lld Iül
~:.\res..: l .:dl lm~.-,., diH'eren.:ö~t·t,,·<Xn pJrentJI.md
l<:<~ht<lnt.:cU ·.,\~It' ~teh.•rmin~.·J ~\n tx.tb ~~nt'
..::,lpynum-~er nnJ ml.N.~ ~proli•'ll it1·el>. ,\l;ltri~el hli"U<•Il :i.s:...\y> ·.,\'r~ u.seJ t-.1 t.'l-umne th~.· Ul\'JSJW f"'Jh.•ntul·.lf 111d.UNtllJ (db.
Re-~ull~: nru~ inhihih·ry ~tf~(( '•'·'··· i•llly ~· ... n in (Cll Uni.'Sc.ltr\'111~ th<llR.\FI't>éll•E muto~<·n. Grt•WUl r·r1•· 1\h.•tin&.:. ~rlt-(t ~.H alsl• vt.~l!lYni in W l\ l nt.(\ JllJ
lvw<r eo··mpJring t•) W,\19~3.\. Furthermc;-e. the relJ-tire mRNA lewis C•f CCNDI ond OPN ·.<ere lüwer in
~.>th'"' istont<dllines!WM~83BresanJ \\-~I9S?·Ar•s cl!. Apj' Ir ing PLX-4720 "' ch'm" JttrJctant.
1\'hl-"~.iBh sllV'\~d higber invasi\-'t'fk'S::.. Hvw~·~. 'n'tth-Jrowal <·l th• drug c~ us,,) reJtKed <ellproUI<r<ltivn.
~unuu.<ry: Pl.X-4 720 can ulhil>it gw.>1h vf BR-\FI' t!ilfer-ent md.>Otatic l"ll•utül of the two c eU lines. ~urth<r
mor". bt·th r<"illant c. U lin.,.>how de<re<l>eJ CCNDI
;.l nJ f'PN ö.:pr~ .. ~·lns.bwasiv~n~s51.lf,,:M98~1\rt~dut'3
n .. t Jitfer !rom that of th< pJt~ntal ceU line w1less
F'L\--47~(1 i~ u~eJ fc·r (h~mo 3ttm..:truu. FinoUy. J
ICg-J-ti'."< eli'<<t ,,f,\rug l'•ithJm~>al >trengthi·ns th,, hyplllh-( ts thJt u~ütant ..:dls..:uuld Je·:eh1' drug. J.t-pt>nJen-cy. ln •)rJ.t-r t~• fut-~ler dara(t~rize th~ gen~lk and
Y,t'n~ t'XJ'l~~~Í·•H ~l\tt'f;ltittUS i.lt tht' ~JlVJUt' lt'\'d arrra
I.'Xp~rill'lt.>lll~ o.lfC' i.n rr•J:;re:.~.
i !hi~ w,w\ li i iS S]ippv:u.~ ~r T-L\!1' _f)~l}.JO·J.J..•j;).(JJJ! Róza Professzornőtől a Népegészségügyi Képző- és Kutatóhelyek Egyesü letének
elnökétől.
Nemzeli Fejles..z:tésl Ugynökség www.ujszechenyiterv.gov.hu 0640638631
' SZÉCHENYI TERV
SZAKMAI BESZÁMOLÓ
K+F projektek esetén
TAMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0024.
Készült: A Debreceni Egyetem tudományos képzési
Debrecen, 2013. szeptember 30.
műhel\ einek támogatása
K+F projekt címe Melanoma diagnosztikai markerek tesztelése
A beszámoló
Dr. Balázs Margit Beszámolási 12011. július 01.-2013.
kiállítója időszak: szeptember 30.
l
A K+F projekt szakmai előrehaladásának, az elvégzett tevékenységek összefoglalása Melanoma invázió meghatározásához kisérleti rendszer beállítása:Vizsgálataim során 22 melanoma sejtvonal invazív képességét határoztam meg BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber használatávaL Ezek között 12 primer tumor eredetű, 5 metasztázis eredetű és 5 egér xenograftból származó szerepelt (1. Táblázat).
Kísérteti paraméterek:
• 5x10A.4 sejtet került a kamrába 500 ul szérummentes tápfolyadékba. Az alsó kamrában 750 ul szérumos tápfolyadék került, ami irányába a sejtek vándoro/nak.
• 24 órás inkubáció 37°C-os C02 termosztátban.
• A kamra felső részén maradó sejteket eltávolítottuk vattapamaccsal, az kamra alsó részére kitapadt inváziós sejteket metanolban fixáltuk (15 perc), és hematoxilin-eozinnal festettük.
• A megfestett sejteket fénymikroszkóp alatt 200X nagyításon számo/tuk, 7 különböző
látótér számolása után kapott átlag adja az invazív sejtszámot
A primer tumor eredetű sejtvonalak közül 5/12 mutatott invazív tulajdonságot, a metasztázis
eredetűek közül 3/5 volt invazív, míg a xenograft sejtvonalak minden esetben rendelkeztek invazív képességgel {5/5) (1. ábra).
Relatív mRNS expresszió:
Az mRNS expresszió meghatározása SYBER-Green alapú kvantitatív RT-PCR elemzéssei történt (2. táblázat) 14 melanoma sejtvonalat vizsgálva. A relatív expressziós érték számítása a Livak módszerrel törént (~~Ct módszer), ahol a kontrol génként a GAPDH szerepelt, kontrol mintának pedig a WM35 sejtvonalat választottuk. A WM35 a legalacsonyabb stádiumú sejtvonalunk, nem invazív, nem képzett metasztázist és RGP fázisú tumorból származik. A gyakran használt normál melanocita kontrol a mi esetünkben azért nem működött, mert nem termel mártix-metalloproteinázokat, és így nem tudtunk ehhez viszonyítani.
Az M24 metasztázis eredetű sejtvonal valamint ugyanezen sejtvonal egérben kifejlődött
. E ..,
l. Táblázat: A vizsgált sejtvonalak paraméterei és invazív képessége
sejtvonal típus fázis invazív tulajdonság
WM35 primer RGP
WM793B primer RGPIYGP kismértékű
WMJ789 pnmer RGPIVGP kismértékű
WM3211 pnmer RGPIYGP nagymértékű
A2058 metasztázis közepes mértékű
WM983B metasztázis
MELUR metasztázis közepes mértékű
M24 metasztázis közepes mértékű
HT168 xenograft közepes mértékű
HT168-Ml xenograft nagymértékű
1. ábra: Átlagos invazív sejtszám. Az invazív képességű primer eredetű sejtvonalakhoz képest (41,7%) a metasztatikus eredetű és xenograft sejtvonalak nagyobb százalékban voltak invazívak (60% és 100%). Minden esetben három független kísérlet átlagát vettem
alapul az invazív képesség meghatározására.