' SZÉCHENYI TERV
TEJVIZSGÁLAT
6. Juh spermium mikroszkópos vizsgálata, szaporodásbiológiai vizsgálatok
A primer kutatásom célja olyan növényi zselatin (agar-agar, carrageenan, alginát, stb.) alapú és a mindennapokban használt állati csontokból kinyert hígítók összeállítása volt. A hipotézisünk szerint a zselatin meggátolja a -friss és mélyhűtést követően felolvasztott- termékenyítő anyagban a spermiumok akroszóma defektusát és csökkenti a dekapacitált sejtek számát. A termékenyítő anyag konzerválása (hűtve tárolás +15 oC;+5oC-on és fagyasztás) során fellépő hőmérsékletváltozás jelentős mértékben károsíthatja a spermium akroszóma és plazmamembránját egyaránt és emiatt a sejt elveszti a termékenyítőképességét. Ebben az évben az alábbi kísérleteket terveztük elvégezni:
Növényi zselatinok és antioxidánsok hatása a kossperma mélyhűthetőségére, minőségi paramétereire
Növényi alapú zselatint tartalmazó hígító esetén az equilibrációs idő optimalizálása
Növényi zselatin és antioxidáns tartalmú hígítóval mesterséges termékenyítést végezni Először növényi zselatinokat oldottunk fel tej alapú és szintetikus (Triladyl, Andromed) hígítókban 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%-os arányban. A zselatinok koncentrációját azért nem növeltük tovább, mert nagyobb koncentrációban már 30 oC felett is gél halmazállapotúvá vált a hígító. Mivel a termékenyítőanyag hígítását 30oC-on végezzük, ezért a hígítónak ezen a hőmérsékleten is folyékony halmazállapotúnak kell lennie. A növényi zselatinokkal nem tudtuk elvégezni sem a hűtve tárolást, sem a fagyasztást. Ennek az volt az oka, hogy a zselatinok feloldása után nem tudtuk homogenizálni a hígítót és emiatt nem volt egyenletes az oldat ozmolaritása. A spermiumsejtek rendkívül érzékenyek a hígító ozmolalitására. Ha a hígító hiperozmotikus (kosspermánál 350 mol felett), akkor a sejtek sokkot kapnak, kapacitálnak és emiatt elvesztik termékenyítőképességüket. Az értékelésnél szintén problémát jelentett, hogy a hígítóoldat nem volt homogén. Mikroszkóp alatt elvégzett motilitás vizsgálatnál a hígítóban fel nem oldódott zselatin darabok akadályozták a spermiumok mozgását, ezáltal rontva a sejtek progresszív molitását. A Kovács-Foote-féle festés értékelését sem lehetett elvégezni, mivel a zselatin darabok is festődtek a Giemsa-festékkel, ezért a festés háttere helyenként olyan erős volt, hogy nem lehetett elvégezni az értékelést az élő/elhalt sejtek arányának meghatározását és az akroszóma állapotának értékelését. A flow citometriás
műszeres vizsgálatot szintén nem lehetett alkalmazni ennél a hígítónál, mivel a nagyobb zselatn partikulák eltömítették volna a citométer szívó csövét, amin keresztül s sejtek áramlanak a lézerhez. Az állati eredetű zselatint viszont sikerült homogenizálnunk, de csak tej alapú hígítóban. A kutatás célja az volt, hogy megállapítsuk a zselatin tartalmú hígító miként befolyásolja az öt napon át, 5oC-on tárolt kosspermiumok életképességét. A hipotézisünk az volt, hogy ha zselatint adunk a spermahígítókhoz, akkor az ötnapos tárolás során a spermiumok tovább megőrzik életképességüket, mint a kontroll hígítókban. A kutatáshoz két alaphígítót használtunk. Az egyik 1,5%-os zsírtartalmú UHT-tej, a másik 1,5%-os zsírtartalmú UHT-tej+5% tojássárgája. Mind a két hígítóhoz 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%-ban adtunk Dr. Oetker lapzselatint. A hígított ejakulátumokat 5 napig +5oC-on tároltuk és 24h-ként mintát vettünk belőlük. A mintákból Kovács-Foote-féle festéssel készítettünk keneteket, amiket fénymikroszkóp segítségével értékeltünk ki. A sejteket öt csoportba soroltuk úgy, mint: élő-ép, élő-sérült akroszómájú, elhalt, élő fejű-elhalt farkú, élő farkú-elhalt fejű. Varianciaanlízis segítségével határoztuk meg, hogy van-e összefüggés a zselatin koncentráció és a spermiumok életképessége, morfológiája között. Az eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a 1,5%-os zsírtartalmú UHT-tej+1,0% lapzselatin, illetve 1,5%-os zsírtartalmú UHT-tej+5% tojássárgája+1,5% zselatinos hígítóban több élő, ép sejt található, mint a kontrollként használt zselatinmentes hígítóban. A zselatin koncentrációja és a spermiumok életképessége, morfológiája között nem volt szignifikáns összefüggés (p<0,05).
A zselatinos spermahígítás mellett a Kovács-Foote-festés továbbfejlesztését végeztük el.
Ezzel kétlépéses festési a módszerrel egyszerre határozható meg az élő/elhalt sejtek arány és az akroszóma állapota. A rutin spermavizsgálatokban a termékenyítőanyag elbírálása a spermiumok motilitása alapján történik. Különböző festési eljárásokkal az élő/elhalt sejtek aránya és az akroszóma állapota is értékelhető, ami pontosabbá teszi a termékenyítőképeség előrejelzését. Egyszerű fénymikroszkópal történő komplex értékelésnél az élő/holt sejtek arányát tripánkék vagy Chicago sky blue, az akroszóma állapotát pedig Giemsa festékkel
dombormű-szerűen kiemelkedő sejteket körülölelve a vékony farkak élő/elhalt értékelését is biztosabbá teszi. Az immerziós olaj folyékony állapota a kenet tárolása során problémát jelent, ezért azt xilolban oldott 1%-os vajsárga (dimethyl yellow, Sigma D6760) és kanadabalzsam (Canada balsam, Sigma C1795) 3:1 arányú keverékével helyettesítettük. Az eredetinél mélyebb sárga színű kanadabalzsam az olajhoz hasonlóan körülöleli a sejteket és jól differenciál, ugyanakkor néhány órán belül megszilárdul, miáltal a kenetek hosszú ideig tárolhatók.
2012 januárjától elkezdtem a 12 hónapos korú fekete dorper kosok (n=8) műhüvelyes spermavételre történő betanítását. A kosok spermatermelése egy éves kor körül válik egyenletessé. Ebben az életkorban már kevesebb a morfológiai rendellenességel rendelkező spermasejtek száma (elsősorban a plazmacsepper, illetve akroszóma defektussal rendelkező vagy dekapacitált sejt). A betanítás egy hónapig tartott. Fiatal állatoknál fontos, hogy a termékenyítőanyag értékelését csak a betanítást követő 14-15. spermavétel után kezdjük el (körülbelül 64-65 nap). Mivel ennyi ideig tart a kosok spermiogenezise. Ez azért fontos, mert az eredmények értékelésénél figyelembe kell venni az állatok tápláltsági állapotát, környezeti tényezőket. 2012 márciusában kerültek a Kismacsi Kísérleti Telepre az egy éves fehér dorper kosok (n=19). A fehér dorper kosok betanítása is egy hónapot vett igénybe, illetve az értékelésnél itt s megvártam az első spermavételtől számított spermiogenetikus ciklus végét.
A kutatásom célja az volt, hogy megállapítsam a dorper és fehér dorper kosok andrológiai jellemzőjét a magyarországi klimatikus viszonyok között és a Kísérleti Telepen alkalmazott tartási-, takarmányozási technológia mellett. A két fajta értékelését külön-külön végeztem, majd összehasonlítottam a kapott eredményeket. 2012. májustól a Kismacsi kísérleti telepen hetente egy alkalmommal történt spermavétel, 6 fekete dorper és 12 fehér dorper kostól. A spemavétel után elvégeztem az ondó makroszkópos, mikroskópos, biológiai vizsgálatát.
Kéthetente herekörméret mérés és mérlegelés volt. Vizsgáltam a sperma mennyiségét, sűrűségét (fotométer, Bürker-kamra), spermiumok motilitását (fénymikroszkóp, flow citométer), morfológiáját és élő/elhalt sejtek arányát, akroszóma állapotát (Kovács-Foote-festés). A kenetek fénymikroszkópos morfológiai értékelését folyamatosan végzem. A fekete dorper kosok vizsgálatának eredményét a 212-ben megrendezett ,, A jövő tudósai - a vidék jövője" - PhD konferencián közöltem és az Agrártudományi Közlemények folyóiratban jelent meg publikáció az eredményekből. A kísérletben hat 15-18 hónapos dorper kos ondójának minőségi és mennyiségi jellemzőit, valamint, herekörméretét vizsgáltuk különböző
évszakokban a Debreceni Egyetem Kísérleti Telepén. Hetente egy alkalommal történt műhüvelyes spermavétel, a herekörméretet (cm) kéthetente mértük. Közvetlenül ugratást követően vizsgáltuk az ondó mennyiségét (ml), koncentrációját (x 109), a spermiumok tömegmozgását (0-5), motilitását (%), és kiszámítottuk az összes spermium számot (x 109).
Az ondó mennyisége ősszel volt a legtöbb (1,4 ± 0,5 ml), míg tavasszal a legkevesebb (1,3 ± 0,4 ml). Az ejakulátumban lévő spermiumok koncentrációja mind tavasszal (2,6 ± 1,5 x 109) mind nyáron (3,3 ± 1,5 x 109) kisebb volt az őszi (4,1 ± 1,1 x 109) időszakhoz viszonyítva (P<0.05). Az összspermium szám (x 109) és a herekörméret (cm) értékei minden hónapban szignifikáns mértékben különböztek egymástól, viszont a spermiumok tömegmozgására és motilitására nem volt hatással az évszakok változása. Összefoglalásként elmondható, hogy a dorper kosok ondójának mennyiségi és minőségi paraméterei, illetve a herekörméret értékei az őszi időszakban voltak a legjobbak.
A fehér dorperek eredményét és a két fajta összehasonlítását ebben az évben fogom közölni.
Augusztus-szeptember hónapban a különböző formalin kocentrációjú spermafixáló oldatokat hasonlítottam össze flow citometriás vizsgálattal. A hipotézisünk az volt, hogy a 4%-os formalin koncentrációjú oldatban fixálódnak a leggyorsabban a sejtek anélkül, hogy károsodna a plazmamembrán, ami a citometriás értékelésénél jelentősen módosítja az eredményeket. A PI DNS-hez kötődő fluoreszens festék, amely az elhalt sejtek jelölésére szolgál. A PI csak akkor tud bejutni a sejtmagba, ha az akroszómamembrán és a plazmamembrán is károsodott. Ezt a károsodást előidézheti a fixáló túl magas formalinkoncentrációja is. Illetve ha túl alacsony formalin koncentráció és a sejtek nem fixálódnak, akkor a PI bejutása a sejtekben nem egyenletes, ami befolyásolja az eredményeket. A formalin koncentrációját 0 és 6% között változtattuk meg 0,5%-os különbségekkel. A fixáló oldat formalin koncentrációja és a citometriás értékelés (SYBR14/PI fluoreszcens festés) során kapott értékek között nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget.
2012. szeptembertől nanoszelénes takarmánykiegészítővel kezeltem 6 fehér dorper kost, hogy
azért fontos, mert juhoknál a napi 7 mg feletti szelén takarmánykiegészítés toxikus. A kezelt csoport 86 napon át naponta kapta a nanoszelént szuszpenzió formájában, orálisan. A szuszpenzióban lévő nanoszelén koncentrációja 3 mg volt. A kísérlet végén a mennyiség, motilitás, sűrűség és a sejtek viabilitása eltérést mutat a kontrol és a kezelt csoport között. A vér szelén koncentrációja is különbözött a kezelt és a kontrol csoportnál. A szeminális plazma profiljának és szelén koncentációjának meghatározása jelenleg is folyamatban van.
A Zaragozai Egyetem, Department of Biochemistry and Molecular and Cell Biology Intézet kutatócsoportjával együttműködésben végzett munka során a kossperma élettani, biokémiai folyamataink megismerésével foglalkoztunk. A kutatás során szintetikus és természetes alapanyagú hígítókhoz adtunk antioxidánst (curcumin), fehérjéket és növényi zselatint (Sodium-alginate) majd a hígított termékenyítőanyagot +15oC-rahűtjük vagy fagyasztottuk.
Az értékelés során vizsgáltuk a friss, hígított illetve felolvasztott termékenyítőanyagban a spermiumok motilitását (CASA-program), koncentrációját, életképességét (fluoreszcens festés), kapacitációs státuszát (CTC-festés, FITC-PNA festés), apoptikus markereket (Annexin-V) a kaszpáz rendszer aktivizálódását (Caspase-3, Caspase -7 assay), a DNS épségét (Tunel-teszt) a spermiumok fertilitását (ZBA-assay). A fehérjékkel végzett kísérlet során a termékenyítőanyagot cervikális termékenyítésre is felhasználtuk. Ebben a kísérletben összesen 130 anyajuhot termékenyítettünk négy részletben. A termékenyítést követő 30-40 napon ultrahangos vizsgálatot végeztünk, hogy megállapítsuk milyen arányban vemhesültek a termékenyített anyajuhok.
A szeminális plazmában lévő fehérjék kriopotektáns hatásának eredményei
A spermium minőségét jellemző tulajdonságok alakulása curcuminnal végzett hűtés során
A spermium akroszóma membránjának változása a hűtési folyamat során
Az szeminális plazma fehérjét és curcumint tartalmazó hígítóval végzett Zona Bindig Assay (ZBA) eredménye