Sejtciklus-dependens módon expresszálódó, új biomarker a mellékvesekéregrák prognózisában

A mellékvesekéreg-karcinóma malignitás mintázatát összehasonlítottuk az NCI-H295R sejtciklusdependens transzkripciós programjával. Összesen 1752 gén mutatott szignifikáns, legalább kétszeres expressziós különbséget ACA és ACC között, míg az S/G1 összehasonlításban 29 gén expressziója változott dinamikusan.

A három reanalizált microarray tanulmány [115–118] átlagában 1752 gén mutatott szignifikáns, legalább kétszeres expressziós különbséget ACA és ACC között. Az S/G1 összehasonlításban 29 gén mutatott szignifikáns, legalább kétszeres expressziós különbséget NCI-H295R humán ACC sejtvonalon. A két lista metszetét a 11. ábra és az 5. táblázat részletezi.

173

65. ábra – Az ACC malignitás mintázatának és az NCI-H295R sejtciklusdependens transzkripciós programjának Venn diagramja – Piros nyilak a szignifikáns felülexpressziót, zöld nyilak a szignifikáns alulexpressziót, a mellettük lévő számok a változó gének számát jelölik.

A metszetben a dupla nyilak a ACC vs. ACA változást (bal nyíl) és a S vs. G1 változást (jobb nyíl) jelölik. A metszethez tartozó gének az 5. táblázatban vannak részletezve. Ábra forrása: [518]

Az S vs. G1 összehasonlításban változó gének többsége része a malignitás mintázatnak is. A két halmaz metszetének tagjai közül az RRM2 (ribonukleotid reduktáz M2 alegység) és az ASPM (abnormális orsó-homológ, microcephalia-asszociált) gének voltak felülexpresszálva mindhárom ACC vs. ACA microarray tanulmányban, emellett az RRM2 mutatta a legmagasabb génexpressziós különbséget S vs. G1 összehasonlításban (37. táblázat). A továbbiakban kutatásainkat az RRM2 irányában folytattuk tovább.

37. táblázat – Az ACC malignitás mintázatának és az NCI-H295R sejtciklusdependens transzkripciós programjának metszetéhez tartozó gének – A 11. ábrán bemutatott Venn diagram metszetéhez tartozó gének és azok expresszióváltozásaik bemutatása. A hiányzó adatok nem szignifikáns vagy FC < 2 szignifikáns eltérések. A malignitás mintázathoz tartozó gének Szabó Péter és munkatársai közlése [118] alapján. Táblázat forrása: [518]

gének

COL1A1 2,680 2,680 -3,805

HOXB13 10,458 10,458 -3,615

A kiválasztott RRM2 sejtciklusdependens expresszióját sikeresen validáltuk sejtciklus szortolt NCI-H295R mintákból mRNS és fehérje szinten is (66. ábra). A korábban leírt észrevételeknek megfelelően, a G1-fázisban alacsony expressziós szint S-fázisban nő meg, ahol a ribonukleotid reduktáz enzimkomplex részeként kulcsfontosságú a ribonukleotid-dezoxiribonukleotid átalakulásban [575].

66. ábra – Az RRM2 sejtciklusdependens expressziójának igazolása sejtciklus szortolt NCI-H295R sejteken – Igazolás mRNS szinten qRT-PCR módszerrel (A) és fehérje szinten Western blot módszerrel (B). Az adatok átlag ± standard deviáció formában vannak ábrázolva.* p<0,05.

Ábra forrása: [518]

Az RRM2 a ribonukleotid reduktáz (RR) enzimkomplex alkotója, mely a ribonukleotid-dezoxiribonukleotid átalakulás katalizálásán keresztül [576] a DNS szintézis sebességének egyik meghatározója [577]. Génje evolúciósan egy transzlációsan szigorúan szabályozott szakaszon van kódolva [578], melynek komoly szerepe van az RRM2 S-fázis dependens aktivitásának kialakításában [575,579]. A transzláció szabályozása mellett az RRM2 relatív rövid féléletideje is hozzájárul a fehérje sejtciklusfüggő aktivitáshoz.

Ezt követően, az in vitro eredmények birtokában után kiváncsiak voltunk, hogy mellékveserákban hogyan expresszálódik az RRM2. Tizenkét, szövettanilag igazolt humán ACC-n végeztünk immunhisztokémiai vizsgálatokat az RRM2 és Ki67 fehérjék meghatározásának irányában. A daganatok jellemzőit a 37. táblázat, az immunhisztokémiai reakciók eredményeit a 67.

ábra szemlélteti (67. ábra).

38. táblázat – A vizsgálatokba bevont ACC minták jellemzése - N: nő, F: férfi.

sorszám nem életkor (év)

legnagyobb átmérő (mm)

módosított Weiss score

Ki67 index (%)

RRM2 score

1 N 62 85 5 14,8 23,3

2 F 79 120 5 7,5 18,2

175

3 N 46 200 6 36,9 56,7

4 F 25 100 6 14,1 17,5

5 N 50 120 5 14,6 18,6

6 N 55 90 6 21,2 28,0

7 N 69 110 6 21,8 44,8

8 N 61 80 5 16,8 26,8

9 N 54 80 5 18,5 30,2

10 N 62 130 6 4,2 15,7

11 N 61 120 5 18,6 27,6

12 N 47 140 5 37,1 86,2

67. ábra – A Ki67 és RRM2 expresszió vizsgálata humán ACC mintákon – 3 reprezentatív minta ugyanazon területének Ki67 (bal oszlop) és RRM2 (jobb oszlop) festődése (A). A kék skála 200 μm-nek felel meg, nagyítás: ×100. A Ki67 index és az RRM2 score korrelációjának vizsgálata (B).* p < 0,005. Ábra forrása: [518]

A korlátozott esetszámon végzett vizsgálatunk kitűnő korrelációt mutatott az egyes ACC-k Ki67 és RRM2 expressziója között. Ez alapján – nagyobb esetszámon végzett hasonló megerősítő eredmények esetén – felmerül az RRM2 expresszió vizsgálatának jelentősége az ACC hisztopatológiai diagnózisában. Korábbi vizsgálatok már igazolták az RRM2, mint proliferációs

marker jelentőségét vastagbélrákban [580,581], emlőrákban [582,583], nem-kissejtes tüdőrákban [584] és hepatocelluláris karcinómában [585] is. A vizsgálatok megerősítették a magas RRM2 expresszió összefüggését a rosszabb prognózissal is [581,583,584].

Az ACC gyógyszeres terápiájában az egyetlen mellékvesekéreg-specifikus szer a mitotán (M) [93], míg a betegség előrehaladott állapotában számos citosztatikus szer alkalmazásával próbálkoznak, korlátozott eredménnyel [586–589]. Munkacsoportunk korábbi vizsgálatai felvetették a 9-cis-retinsav ( R ) potenciális terápiás hatékonyságát ACC-ben, míg a jelen munkánk beazonosította az RRM2-t, ami egyrészt jó diagnosztikai marker lehet ACC-ben, de esetleg a hasnyálmirigyrákhoz hasonlóan terápiás célpontként is vizsgálható. A gemcitabin (G) specifikus RRM2 gátlószer. Ezen előzetes eredmények alapján a következő kísérletsorozatban megvizsgáltuk az RRM2 expressziót az ACC-ben alkalmazott kemoterápiás kezelések után.

68. ábra – A különböző kezelések hatása az NCI-H295R sejtek proliferációjára, apoptózisára, kortizoltermelésére és sejtciklusára – Az ábra a proliferációra (A), az apoptózira (B), a kortizoltermelésre (C) valamint a sejtciklus fázisainak megoszlására 24 (D), 48 (E) és 72 (F) órás kezeléseket követően mért értékeket mutatja be. K – kontroll, G – gemcitabin, M – mitotán, R – 9-cisz-retinsav. Az adatok átlag ± standard deviáció formában vannak ábrázolva. A csillagok (A-C) és a fehéren pontozott oszlopok (D-F) a kontrolltól való szignifikáns (p<0,05) eltérést jelölik. Ábra forrása: [518]

177

Ahogyan az a 68. ábrán látható mindegyik kezelés csökkentette a sejtek proliferációját, a G kezelés már korábbi időpontokban és nagyobb mértékben csökkentette a proliferációt. Ennek hátterében a G apoptózist serkentő szerepe állhat [586]. Mivel egy korábbi, a G hatásait az NCI-H295R sejtvonalon vizsgáló közlemény nem vizsgálta a G hatását a sejtvonal szteroidtermelésére, megvizsgáltuk a kortizoltermelésre gyakorolt hatását. Amíg a M esetében sikerült kimutatnunk a korábbiakban már igazolt adrenolítikus hatását [590], a G nem befolyásolta az NCI-H295R sejtvonal kortizoltermelését. A sejtciklus fázisainak eloszlását célzó vizsgálataink a G1 fázisú sejtek arányának megnövekedésével igazolták a G korai S-fázist gátló hatását [586]. A M és a R emelte a G2 fázisú sejtek arányát, a kombinált, 24 órás kezelés hatására a sejtek majdnem 30%-a tartózkodott a G2 fázisban. Ez az eredmény is egybecseng a korábbi megfigyelésekkel, miszerint a M a G2 fázist gátolja [591,592], míg a R a sejtciklus G2/M átmenetet moduláló hatásával is részt vesz a R daganatellenes hatásának kialakításában [118,587].

Ezt követően a három szer hatását elemeztük az RRM2 expresszióra (69. ábra).

69. ábra – A különböző kezelések hatása az NCI-H295R sejtek RRM2 expressziójára – Az RRM2 mRNS expressziója a különböző kezelések hatására (A). Az adatok átlag ± standard deviáció formában vannak ábrázolva. Az RRM2 fehérje expressziója a különböző kezelések hatására (B). K – kontroll, G – gemcitabin, M – mitotán, R – 9-cisz-retinsav.* p<0,05. Ábra forrása:

[518]

A gemcitabin – a kezelési időtől függetlenül – háromszorosára emelte az RRM2 mRNS szintjét NCI-H295R sejtekben és a 48 órás minták fehérjelizátumain végzett Western blot vizsgálatok igazolták a gemcitabin RRM2 expressziót fokozó hatását fehérjeszinten is.

Irodalomban korlátozott adatok érhetőek el az RRM család onkológiai kezelések során bekövetkező változásairól. Nakamura és munkatársainak korábbi eredménye szerint a kezelést megelőző magasabb RRM1 expresszió a gemcitabinra adott terápiás válasz korlátozottabb hatékonyságát vonja maga után az epeutak rosszindulatú daganatában [527]. Emellett, a kis interferáló RNS (small interfering RNA – siRNS) és miRNS mediálta RRM2-csendesítés visszaállítja a daganatok gemcitabin-szenzitivitását hasnyálmirigyrákban [593,594]. Ezek alapján arra következtetünk, hogy a G kezelés következtében létrejövő RRM2 expresszió-fokozódás egy gemcitabinnal szemben kialakuló kemorezisztencia következménye. Ez magyarázhatja a G relatív hatástalanságát az ACC terápiájában [589].

VI.2.13. A keringésben jelen lévő mikro-RNS-ek mint biomarkerek a hormon-rendszer