II.6.1. A mikro-RNS-ek jellemzői és biogenezise
A mikro-RNS-ek 16–29 nukleotidból álló nem kódoló RNS-molekulák, amelyek az ún.
RNS-interferencia révén szabályozzák a géntranszkripciót, irodalmi adatok alapján a humán génátiratok kb. 30–50%-ának szabályozzásában vesznek részt [402,403]. Az első mikro-RNS-t két kutatócsoport egymástól függetlenül fedezte fel. Kimutatták, hogy a lin-14 génnel komplementer lin-4 gén által kódolt 22 nukleotidból álló RNS-molekula a lin-14 gén expresszióját gátolja poszttranszkripciós szinten [404,405]. A mikro-RNS-ek valódi jelentőségét azonban csak azután ismerték fel, miután különféle fajokban számos hasonló, kisméretű RNS-t azonosítottak [406,407].
A mikro-RNS-eket kódoló gének gyakran más gének intronjaiban találhatók, és az adott gén (host gén) promóterének és szabályozó elemének felügyelete alatt állhatnak, míg más mikro-RNS gének a genom nem-kódoló részén policisztronos clusterekben, vagy egyszerűen önmagukban helyezkednek el [408]. A mikro-RNS génekről átíródó primer transzkriptum (pri-miR) az RNS-polimeráz-II közreműködésével képződik a sejtmagban. A pri-miR-t a sejtmagban endonukleáz (Drosha) hasítja prekurzor miR-ré (pre-miR). Ezek a pre-miR-ek 60–100 nukleotidból állnak, és jellegzetes hajtűszerű szerkezettel rendelkeznek. A sejtmagból egy exportin-5 nevű fehérje (RanGTPáz) segítségével jutnak ki a citoplazmába, majd egy citoplazmatikus ribonukleáz (Dicer) közreműködésével a hajtűszerű pre-miR-ből kettős szálú RNS-molekula képződik (13. ábra). A duplex szálainak szétválását követően az egyik szálból keletkezett 16–29 nukleotid méretű érett mikro-RNS-fehérje komplexbe integrálódik, melyet RISC-nek neveznek (RNS induced silencing complex). Ez a komplex hozza létre a cél-mRNS lebomlását vagy a transzláció gátlását; a mikro-RNS hozzákötődik az mmikro-RNS 3’ nem átíródó végéhez (3’UTR, untranslated region). Növényekben ez a mikro-RNS–mRNS kötődés csaknem teljes komplementaritás alapján jön létre és az mRNS lebomlását eredményezi. Állati és humán sejtekben ez a kötődés nem tökéletes, de a transzláció gátlását, valamint az mRNS degradációját okozhatják [409].
13. ábra. A mikro-RNS-ek biogenézise
A mikro-RNS-ek biológiai jelentősége sokrétű, szerepük van a sejtproliferáció, a sejtdifferenciálódás, az egyedfejlődés, a celluláris jelátvitel, a sejthalál szabályozásában, és jelentőségük lehet különböző betegségek, köztük a daganatok patomechanizmusában [410–414].
Humán daganatokban lehetséges jelentőségükről 2002 óta közölnek adatokat. Számos daganattípusban, köztük krónikus lymphoid leukaemiában, tüdőtumorban, köpenysejtes lymphomában, colorectalis carcinomában, emlő- és pajzsmirigy-carcinomában, glioblastomákban és hypophysis daganatokban találtak megváltozott mikro-RNS expressziós profilt [405,415–422].
Több tanulmányban kimutatták, hogy az adott daganatban jelentőséggel bíró gén expressziója negatívan korrelál a specifikus mikro-RNS expressziójával, aminek alapján a mikro-RNS–eket funkciójuk szerint onkogénnek vagy tumorszuppresszornak minősítjük. A mikro-RNS-expressziós mintázat egyes daganatokban tükrözi a típus és stádium eltéréseit [416,423].
II.6.2. A mikro-RNS -ek szerepe hipofízis adenomákban
A mikro-RNS-ekkel kapcsolatos kutatásunk kezdetén az NCBI Pubmed adatbázisa
„microRNA AND pituitary” keresőszavakra mindössze 16 találatot adott. Ezek között 5 foglalkozott ténylegesen a hipofízis mikro-RNS eltéréseivel: négy az adenomák patogenezisével kapcsolatban, egy pedig a GnRH hatásra bekövetkező mikro-RNS-expressziós profil változását vizsgálta. Bottoni és mtsai által készített RNS microarray 30 eltérően expresszálódó
mikro-71
RNS -t azonosított a normális és adenomás szövetekben. A szerzők valószínűsítették, hogy a hipofízis adenomákban fokozottan expresszáltnak talált miR-150, miR-152, miR-191 és miR-192 befolyásolhatják a sejtproliferációt a korábban közölt vizsgálatok alapján [424]. Az adenomák méretével összefüggően 6, míg bromocriptin kezelés hatására szintén 6 mikro-RNS eltérő expresszióját mutatták ki. Az adenomákban csökkent expressziójú miR-16-1 kísérletesen megerősített célpontja, a BCL2 a daganatok egyharmadában fokozottan expresszálódott, így lehetséges, hogy a miR által szabályozva részt vesz ezeknek a daganatoknak a kialakulásában [415].
ACTH termelő adenomákban 8 csökkent működésű mikro-RNS-t azonosítottak, melyek klinikummal összefüggését nem sikerült bizonyítani [425].
A mikro-RNS-ekhez kapcsoló kutatás során nem elegendő beazonosítnai a mikro-RNS-eket, hanem a biológiai hatásuk megértéséhez szükséges a feltételezett célgénjeikkel történő interakciót is bizonyítnai. Hipofízis vonatkozásában riportergén-kísérlettel igazolták a let-7-HMGA2 közötti interakciót, amelyek expressziója közötti negatív korreláció a hipofízisben patogenetikai szerepükre utalhat [300].
II.6.3. Mikro-RNS-ek szerepe a sejtciklus szabályozásában
Daganatképződés során a protoonkogéneket targetáló miRNS-ek (TS-miR – tumor szuppresszor mikro-RNS) csökkent és a tumor szuppresszor géneket targetáló mikro -RNS-ek (onko-miR – onkogén mikro-RNS-ek) emelkedett expresszióját írták le [426,427]. Elsőként a hsa-miR-16 család tagjait – mint TS-miR-ek – kódoló genomikus lókusz delécióját írták le krónikus limfoid leukémiában [416]. Később igazolódott, hogy a mikro-RNS-eket kódoló gének több mint fele olyan kromoszómális lokalizációkon kódolódik, melyek a daganatképződés során gyakran deletálódnak vagy válnak transzkripcionálisan elcsendesítetté [417]. A 14. táblázatban néhány példát hozunk olyan mikro-RNS – cél mRNS interakciókra, melyeknél a TS-mikro-RNS-ek csökkent kifejeződése együtt járt a targetált protoonkogén sejtciklus regulátor (ciklinek, CDK-k) felülexpresszálódásával, vagy az onkomiR emelkedett kifejeződése következtében a targetált tumor szuppresszor sejtciklus regulátor (CDKi) csökkent módon fejeződött ki [428].
A sejtciklus regulátorainak és a mikro-RNS-eknek a kölcsönhatása nem egyirányú. Bueno és munkatársai szérum sokkot alkalmazva kimutatták, hogy a sejtciklusdependens expressziót mutató E2F1 és E2F3 transzkripciós faktorok fokozzák az ismerten TS-miR funkciójú miR-16 és hsa-let-7 család tagjainak expresszióját és – a replikációs stressz kivédésén keresztül – segítik az E2F-mediálta sejtciklus progresszió finomhangolását [429]. Ofir és munkatársai ezzel egybehangzóan igazolták, hogy az E2F1-mediálta miR-15 expressziófokozódás ciklin E-re való csendesítő hatása negatív előrecsatolás útján járul hozzá a G1/S átmenet finomhangolásához [430].
14. táblázat – Mikro-RNS-ek szerepe a sejtciklus regulátorainak szabályozásában daganatképződés során – Piros háttér a dagantokban észlelt emelkedett, zöld háttér a daganatokban észlelt csökkent expressziót jelzi ép szövetekhez képest. Az egyes mikro-RNS-mRNS fizikai interakciói a hivatkozott cikkekben kerültek bizonyításra [321].
Sejtciklus regulátor D2 ciklin hsa-miR-29c gyomorrák
D3 ciklin hsa-let-7b melanóma malignum E1 ciklin
hsa-miR-132 oszteoszarkóma
hsa-miR-7 hepatocelluláris karcinóma hsa-miR-15a emlőrák
A ciklin hsa-let-7b melanóma malignum
B1 ciklin hsa-miR-410 gonadotróp hipofízis adenóma hsa-miR-379 emlőrák
A sejtciklusdependens mikro-RNS transzkripciós program vizsgálatára további kísérletek is történtek. Bueno unkacsoportja ellett Rissland és munkatársai kimutatta a hsa-miR-16 család expressziójának dinamikus változását szérum hatására [431]. HeLa sejteken timidin szinkronizálást követően történt RNS mérés során 25 sejtciklus depedendens expressziót mutató mikro-RNS-t igazoltak [432].
Mindezen előzetes eredmények alapján kutatómunkánkban a sejtciklus-dependens, dinamikus mikro-RNS expresszió vizsgálatát tűztük ki célul, abból az okból, hogy esetleg beazonosíthassunk olyan mikro-RNS-eket, amelyek módosításával a sejtciklus is módosíthatóvá válik.
73 III. CÉLKITŰZÉSEK
I. Örökletes endokrin tumorszindrómákért felelős genetikai eltérések beazonosítása a hazai beteganyagban:
1. A RET protoonkogén mutációk geno-fenotípus összefüggései MEN2 szindrómában 2. A VHL gén eltérések vizsgálatával beazonosítani a hazai von Hippel-Lindau
szindrómában szenvedő betegeket
3. A VHL gén Ser80Ile és a Pro25Leu variánsok patogenetikai szerepének tisztázása
4. A phaeochromocytomára és paragangliómára hajlamosító géneltérések közül a szukcinát dehidrogenáz enzim (SDH) alegységeit kódoló gének (SDHB, SDHC, SDHD: SDHx gének) és a TMEM127 mutációnak hazai feltérképezése
5. Az SDHx gének aminosavcserével járó génvariánsok fenotípust módosító szerepének tisztázása MEN2-s betegekben
6. Bemutatni az együttesen előforduló SDHC és PTEN mutációkkal társult klinikai fenotípust
7. Feltérképezni a csírasejtes SDHx variánsok hatását Cowden és Cowden-szerű szindrómában szenvedő betegekben
8. A szukcinát hatásainak összegzése a tumorigenézisben, új jelátviteli mechanizmusok megismerése céljából
9. A MEN1 szindrómáért felelős menin mutációk beazonosítása és a társult fenotípus tisztázása hazai betegekben
10. MEN1 szindrómában előforduló mellékvesedaganatok és a menin és interakciós partnereinek szerepe a mellékvesekéreg daganatok patogenézisében, a menin dinamikus interakciónak bemutatása a tumorigenézisben
11. Nemzetközi együttműködés keretén belül új genotípus-fenotípus összefüggések feltárása MEN2 és örökletes Phaeo/PGL-ákban
II. A helyi (szöveti) hormonhatásban szerepet játszó fehérjéket kódoló gének: a