A VHL gén eltérései hazai von Hippel-Lindau szindrómában szenvedő betegekben A von Hippel-Lindau (VHL) szindróma egy ritka, több szervet érintő, autoszóm dominánsan

öröklődő kórkép. Munkám során a hazai VHL szindrómában szenvedő betegek mutációvizsgálatát végeztük el. Hét család 35 tagja és 37 látszólag sporadikus megjelenésű Phaeo–val került kivizsgálásra. Betegség-okozó mutációt mind a hét VHL szindrómában szenvedő családban és 3 Phaeo-s betegben sikerült detektálnunk. A pontmutációk mellett két nagy és egy 2 bázist érintő deléciót is kimutattunk. A genotípus-fenotípus adatokból kitűnik, hogy a deléciókkal és Stop kodont eredményező mutációk során a VHL szindróma 1-es típusa (nincs Phaeo) a klinikai megjelenés, míg aminosavcserével járó pontmutációk a VHL szindróma 2-es típusát eredményezik. A kutatómunka során szükséges volt az ún. nagy géndeléciók detektálásnak kidolgozása is mert a VHL szindrómáért felelős géneltérések kb. 10-15 % ilyen hiba, és ezeket DNS szekvenálással nem lehet azonosítani. Erre kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciót és multiplex ligációs próba amplifikációt (MLPA) végeztünk (14. ábra) [436].

14. Ábra: a VHL gén nagy delécióinak kimutatásában használt módszerek. A panel: az MLPA módszerrel igazolt 2-es exon deléció, B panel: kvantitatív valós idejű PCR-el igazolt 3-as exon deléció

101

A nagy deléció vizsgálat bevezetésével az 1998-2009-es időszakban a hét VHL szindrómában szenvedő családból 2 esetben (28,5%) találtunk meg a kórképért felelős nagy deléciókat, ami megerősítette az irodalmi adatok alapján várható gyakoriságot és felhívja a figyelmet arra, hogy a molekuláris biológiai módszereket egymással kiegészítve kell alkalmazni a klinikai genetikai vizsgálatok során.

26. Táblázat: Hazai VHL szindrómás és látszólag sporadikus Phaeo-ban szenvedő betegek VHL gén mutációanalízisének valamint a klinikai fenotípus eredményei

Családok Családtagok Veserák géndeléció. Ezek mellett egy benignus VHL génvariáns (P25L) is kimutatásra került (26. táblázat).

Ezen genetikai eltérések a teljes VHL génben elszórtan találhatóak meg és nem ismétlődnek családok között, vagy tömörülnek mutációs hot spot-ba (16. ábra). A csonkolt, vagy hiányzó VHL fehérjét eredményező génmutációk csak a VHL-szindróma 1-es típusába sorolt családoknál fordultak elő, míg a missense mutációk döntően, de nem kizárólag a VHL-szindróma 2B és 2C típusában. A hazánkban tapasztalt mutációs spektrum lényegesen nem különbözik a nyugati, japán, vagy kínai populációkban találtaktól [67,437]. Az egyik legnagyobb beteganyagot feldolgozó

tanulmányban 6 mutációs hot spot-ot azonosítottak, melyek közül kettő (R161X és R167Q) a saját beteganyagban is fellelhető volt [65].

A beazonosított mutációk közül egy, a c.354_355delCT volt új mutáció. Ez és az R161X mutáció is csonkolt, jelentősen károsodott működésű VHL fehérjét eredményez, ami patogénnek tekinthető. A két különböző nagy géndeléció szintén súlyos funkcionális következménnyel járt, betegeinkben a VHL-szindróma 1-es típusát okozta. Ez az összefüggés is megfelel az irodalmi adatok alapján vár összefüggésnek, de találkozhatunk belga és lengyel családokkal ahol ún. csak központi idegrendszeri haemangioblastomaként („CNS (central nervous system) haemangioblastoma only”) manifesztálódó kórformát mutattak ki nagy géndelécióhoz társulva [438,439].

Az R161X csonkoló mutációt hordozó, fiatal, VHL-szindróma 2-es típusába sorolt index betegben enyhe polyglobulia is jelen volt. Ennek hátterében veseeltérést és inadekvát eritropoietin (EPO) túlprodukciót nem tudtunk kimutatni. A VHL gén mutációit leírták Chuvash-polycythaemiában, amiben a VHL-szindrómához kapcsolódó tumorok nem fordulnak elő [440–

446]. Az alapvető genetikai különbség a két betegség között az, hogy míg a VHL-szindróma autoszomális domináns módon addig a Chuvash-polycythaemia autoszomális recesszív módon öröklődik, így a betegekben csírasejtesen homozigóta, vagy compound heterozigóta VHL mutációt lehet azonosítani. Betegünk esete kapcsán felmerül, hogy a polyglobulia kimutatásának esetleg szerepe lehet a VHL-szindróma fenotípus előrejelzésében [447,448]. Az irodalomi adatok feldolgozása során nem találtunk olyan közleményt, amelyben olyan módon vizsgálták volna erythrocytosis jelenlétét VHL-szindrómában, hogy azt nagy valószínűséggel nem renalis eredetű EPO túltermelés okozta volna, habár a betegek 5-20 százalékában erythrocytosis előfordulásáról számoltak be. Arról nem sikerült irodalmi adatot találni, hogy a homozigóta VHL mutáció miért nem okoz tumorképződést Chuvash-polycythaemiában.

További érdekes manifesztáció volt az egyik R167Q mutációt hordozó betegben kimutatott patkóvese, ami extrém ritkán fordul elő VHL-szindrómában [449]. Ennek oka lehet, hogy az embrionális fejlődés korai szakaszában a mesonephros caudalis irányú vándorlásának rendellenességeként alakul ki a patkóvese, amiben a VHL fehérjének is szerepe lehet [450].

VHL-szindrómás családok vizsgálatakor a Phaeo előfordulása 30% körüli [39], melynek saját eredményeink is megfelelnek: 7 családból 3, 18 klinikailag érintett egyén közül 5 esetben mutattuk ki. A látszólag sporadikus Phaeo esetében a VHL gén defektusai 0-11 százalékban igazolhatóak [56,76,451,452]. Azokban a tanulmányokban, amelyek ennél nagyobb gyakoriságról számoltak be [453], az adott populációban tapasztalt VHL mutáció alapító hatásának” (founder effect) tulajdonítható [454]. Saját eredményeink is a 10% körüli prevalenciát mutatták, a 37, egymással rokoni kapcsolatban nem álló egyén közül 3 esetben (8,1%) találtunk csírasejtes VHL

103

gén mutációt szövettani vizsgálattal igazolt, sporadikus, egyoldali Phaeo-ában. Mindhárom egyénnél különböző mutációt (L63P, Y156C és R167G) találtunk, mely alapján az „alapító hatás”

lehetősége elvethető volt. Ezen mutációkat korábban VHL-szindróma esetén írták le. Az R167 aminosavat érintő missense jellegű mutációk VHL-szindrómában gyakran társulnak Phaeo-hoz [68], mely esetünkben R167G kapcsán Phaeo-hoz, az R167Q kapcsán VHL-szindróma 2-es típusaként jelentkezett.

15. Ábra: A hazai VHL szindrómában betegekben igazolt VHL mutációk funkcionális következményei a VHL fehérjén belüli elhelyezkedésük alapján

Az igazolt VHL mutációk funkcionális következményeinek tisztázásában az első lépés a mutációk okozta aminosavcserék beazonosítása a VHL fehérje szerkezetében. Ahogyan a 15. ábrán látszik az S80-as kodon – az S68, S72 és S65 aminosavakkal együtt – olyan fontos foszforilációs hely, ami a glikogén-szintáz-kináz 3 (GSK3) szubsztrátja a pVHL30 fehérjében [455]. A GSK3 több olyan jelátviteli útvonal alkotóeleme, amelyek több szolid daganatban is károsodhat. Másik fontos összefüggés, hogy ezek a szerin aminosavak szerepet játszanak a mikrotubulus dinamika megváltoztatásában is. Lolkema és munkatársai mutatták ki, hogy más, szintén a savas kémhatású, N-terminális végen található szerin aminosavak (S33, S38 és S43) foszforilációja a HIF1α-független tumorszuppresszor hatáshoz vezet [456].

A látszólag sporadikus Phaeo-ban szenvedő betegekben igazolt VHL csírasejtes mutációk funkcionális következményei is megbecsülhetőek a fehérje szerkezetből. A β-domén első

aminosava az L63, melynek L63P mutációja esetén a leucin lánctörő prolinra cserélődik [457], míg az Y156 aminosav az α- és β-domén kritikus kapcsolódási pontjának bizonyult [72], így mindkét mutáció következtében kóros, megváltozott funkciójú fehérje jön létre.

V.1.3. A VHL gén Ser80Ile és a Pro25Leu variánsok patogenetikai szerepének tisztázása A VHL szindróma genetikai vizsgálata során látóterünkbe került egy több generációs család (16. ábra). A vizsgálatok az index betegben két aminosavcserével járó mindazidáig nem ismertetett génvariánst: AGT80AAT (p.Ser80Ile) c.239G>A, és a CCT25CTT (p.Pro25Leu) azonosított. A család 32 tagjának klinikai és genetikai vizsgálata bebizonyította, hogy ezek közül a Ser80Ile mutáció felelős a betegségért, míg a p.Pro25Leu variáns egy ártalmatlan génpolimorfizmus. A családfa, szekvenciaelemzés konzerváltságának vizsgálata és a vad és mutáns fehérjék 3D szerkezetének modellezése megerősítette eredményünket [458].

16. Ábra: A VHL gén Pro25Leu és Ser80Ile variánsokat hordozó család családfája. A sötéttel kiemelt betegek a Ser80Ile mutációt, az üres jelölővel ellátott tagok vad típusú gént, míg a vízszintes vonalazású családtagok a Pro25Leu polimorfizmust hordozzák. Egy tag (II/1.) mindkét eltérést hordozta [458].

A két VHL génvariáns patogenitásának megítélésben DNS szekvenciaillesztést és 3D molekulamodellezést is használtunk (17. Ábra). Ezek alapján látható, hogy a 80-as pozicióban található szerin konzervált, míg a 25-ös pozíció nem konzervált a különböző fajokban. Szintén

105

látható, hogy a 80-as pozicióban a szerin cseréje izoleucinná a molekula térszerkezetét átrendezi, ami a VHL funkciója szempontjából kritikus lehet.

17. Ábra: a VHL Pro25Leu és Ser80Ile variánsok konzerváltságának analízise és a Ser80 és Ile80-as variánsok 3D-s modellje

A családfa, a konzerváltság és a molekula térszerkezet alapján kijelenthető, hogy ebben a családban a Ser80Ile variáns volt felelős a betegség kialakulásáért, míg a Pro25Leu egy ártalmatlan génvariáns.

V.1.4. A szukcinát dehidrogenáz enzim (SDH) alegységeit kódoló gének (SDHB, SDHC,