Komponens csúcsok azonosítása a fémion és a ligandum mólarányának

Növelve a mintában a ligandum mennyiségét, a szabad EDTA csúcsok területe lineárisan nőtt, míg a fémkomplex és a kloridion csúcsának területe nem változott, miután a sztöchiometriai arányoknak megfelelő mennyiségű ligandumnál többet tartalmazott a mintaoldat (2.30. ábra).

a)

b)

2.30. a) és b) ábra. A Cu-EDTA^2- komplex és a szabad EDTA ligandumok csúcsterületének változása az EDTA : fémion arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03.

Az 1. mérési pontban, amely a sztöchiometriai számításoknak megfelelő mennyiségű ligandumot tartalmazó mérések eredményeit jeleníti meg, várakozásunknak megfelelően nem kaptunk szabad ligandum csúcsokat.

Az EDTA ligandum EDTA^4- és HEDTA^3-, valamint a NaHEDTA^2- formája is kimutatható az anioncsere kromatográfia segítségével, amint a ligandum mintabeli koncentrációja meghaladta a sztöchiometrikusan szükséges mennyiséget. A kloridion csúcsterülete állandó a várakozásnak megfelelően és jelenlétének az az oka, hogy a fémeket kloridsóik formájában használtuk a mintakészítésekhez. A 2.30. ábrán látható, hogy a koeluálódó 3-szorosan és 4-szeresen negatív töltésű EDTA csúcs alatti területe meredekebben nő, mint a NaHEDTA 2-ioné. Az elválasztásokhoz alkalmazott karbonát eluens pH-ja 11,03 volt. Ezen a pH-n az EDTA ligandum móltörteloszlása: 82,95 % EDTA^4- és 17,05 % HEDTA^3-. A [Cu-EDTA] 2-csúcsterülete nem változik, mivel koncentrációja a ligandum-fém aránnyal nem változik, mert a minta nem tartalmaz szabad fémiont.

Az EDTA 3-szorosan és 4-szeresen negatív formái gyors egyensúlyi reakciókban alakulnak egymásba, ezért ez a két anion egy csúcsban eluálódik. Az egymásba átalakuló ionok (NaEDTA^3-, NaHEDTA^2- és Na₂EDTA^2-) átalakulási sebessége jelentős hatással van a minták elválasztására [72, 73]. A komponensek egymástól függetlenül vándorolnak és csak az effektív diffúzió (molekuláris-, örvény diffúzió és tömegtranszfer ellenállás) okozhat sávszélesedést. A Na₂H₂EDTA oldatában a következő egyensúlyok állnak be [79]:

2 1

2.31. ábra. Az eluensben létrejövő egyensúlyi viszonyok

ahol K1 = 10^10,26, K2 = 10^6,16, KNaL = 10^1,79, KNa(NaL) = 10^0,68, KNa(HL) = 10^0,49, KH(NaL) = 10^8,96. A KH(NaL)-t K1KNa(HL) / KNaL-ként vezettük le. [79]

A 2.32. ábra a különböző EDTA származékok moláris frakcióit ábrázolja a Na⁺ koncentráció függvényében, a pH = 10,1. Ez az ábra egyértelművé teszi, hogy az elválasztások során használt Na⁺-koncentrációtartományban (szürkével jelölt terület) az EDTA három fő formája a négy- és háromértékű ligandum és a háromértékű NaEDTA^3- kelát komplex. Habár ezek a komponensek az összes EDTA-ion valamivel több, mint 90%-át teszik

ki, a protonált (NaHEDTA^2-) és a kétmagvú kelát komplex (Na₂EDTA^2-) is kimutatható az oldatban.

2.32. ábra. Az EDTA ionok móltörtjei a Na⁺- koncentráció függvényében pH = 10,1 esetén.

Szaggatott vonal: EDTA^4-; pont-vonal: HEDTA^3-; vastag folyamatos vonal: NaEDTA^3-; pontozott vonal: NaHEDTA^2-; folyamatos vonal: Na2EDTA^2-. A szürke terület az elválasztások során alkalmazott eluens-Na⁺-koncentrációtartományt jelöli.

Az egymásba átalakuló ionok elválaszthatók Giddings alapján [72], ha az átalakulás sebessége kellően kicsi, vagy ha nem játszódik le az egymásba alakulás. Ha az egymásba átalakulás sebessége nagy, a két ion azonos időben hagyja el az oszlopot. Mivel az EDTA^4- és HEDTA^3- protonálódás / disszociáció sebessége nagy (nanoszekundum nagyságrendű), nem lehetséges az elválasztásuk, együtt eluálódnak. A multispeciesz eluens / minta retenciós elméletnek [19] megfelelően a közös csúcsuk retenciós faktora az egyes csúcsok retenciós faktorainak és az elúció pH-jának megfelelő móltörtjeik hányadosának összege. Mivel a fém-kelát komplex protonálódása együttjár a komplex szerkezeti változásával, a NaEDTA^3- / NaHEDTA^2- protonálódás / disszociáció hányadosa elég lassú ahhoz, hogy el lehessen őket választani egy kromatográfiás folyamatban. Ezzel analóg módon a NaEDTA^3- és a Na2EDTA^2- is elválasztható egymástól. Ennek megfelelően négy különböző EDTA-csúcs azonosítható ionkromatográfiával a mintaoldat összetételétől függően. Ezek a csúcsok: (1) az EDTA^4- és HEDTA^3- közös csúcsa, (2) NaEDTA^3-, (3) NaHEDTA^2- és (4) Na2EDTA^2-. Az elválasztások során alkalmazott Na⁺-koncentrációtartományban a két utóbbi komponens móltörtje kicsi (2.32. ábra), ezért ennek a két ionnak a csúcsa a detektálás érzékenységétől függően figyelhető meg.

A 2.33. ábrán karbonát eluensben oldott Na₂H₂EDTA kromatogramja látható. Négy egymástól elhatárolható csúcs található a kromatogramon. Az első a rendszer holttérfogatában megjelenő kationcsúcs. E csúcs megjelenésének az az oka, hogy a szuppresszor a mintával injektált kationokat csak részben távolította el. Ennek eredményeként viszonylag nagy kation-csúcs jelent meg a kromatogramm elején. A maradék négy kation-csúcs az adott körülmények között jelenlévő EDTA ion. A 2.32. ábrán bemutatott móltörtekből kikövetkeztethető, hogy a második csúcs a NaEDTA^3- ionnak felel meg, mivel ez a komponens jelenti a második legnagyobb frakciót. A legnagyobb csúcs a két szabad EDTA ligandum közös csúcsa (disszociált négyértékű és protonált háromértékű forma). A negyedik és az ötödik csúcs a protonált és a kétmagvú kelátnak felel meg.

2.33. ábra. Eluensben oldott Na2H2EDTA elválasztása. (1) csúcs: kationok (t0); (2):

NaEDTA^3- (tR=5,40min) ; (3): EDTA^4- és HEDTA^3- (tR=6,93min); (4): NaHEDTA^2- (tR=14,70min); (5): Na2EDTA^2- (tR=17,32min). Oszlop: AS9-HC, eluens: 8,0 mM Na2CO3 / NaHCO3, pH = 10,27.

A 2.34. ábrán összefoglaltuk azoknak a méréseknek az eredményeit, amelyek során a ligandum koncentrációját állandónak tartottuk, és a fémion mennyiségét növeltük. Ebben az esetben a komplex csúcs alatti területe lineárisan nőtt, és ennek megfelelően a kloridion csúcsterülete is, míg a szabad ligandum csúcsok mérete csökkent a komplexképződési reakcióban elreagáló mértékben.

a)

b)

2.34. a) és b) ábra. A Cu-EDTA^2- komplex és a szabad EDTA ligandumok csúcsterületének változása a fémion : EDTA arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na₂CO₃, pH = 11,03.

A 2.30. és 2.34. ábrán bemutatott mérések eredményei bizonyították – a komplexképződés folyamatát figyelembe véve – a csúcsok azonosításának helyességét. Elvégeztük ezeket a kísérleteket a cink esetében is, hasonló eredménnyel. Cu-DCTA^2- és Zn-DCTA 2-komplexekkel is elvégeztük ezeket a vizsgálatokat. A DCTA ligandum az EDTA kelátképzővel analóg módon viselkedett. (2.35., 2.36. ábra) Az elválasztások pH-ján a DCTA ligandum móltörteloszlása: 15,01 % DCTA^4- és 84,99 % HDCTA^3-.

0 10 20 30 40 50 60 70

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

[Cu²⁺] : [DCTA]

csúcsterület [µSsec]×107

Cl- DCTA4- + HDCTA3- [CuDCTA]2-

NaHDCTA2-2.35. ábra. A Cu-DCTA^2- komplex és a szabad DCTA ligandumok csúcsterületének változása a fémion : DCTA arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03

2.36. ábra. A Zn-DCTA^2- komplex és a szabad DCTA ligandumok csúcsterületének változása a DCTA : fémion arány függvényében. Eluens: 9,0 mM Na2CO3, pH = 11,03

A két tanulmányozott fémion a vizsgált pH-tartományban számításaink alapján csak egyféle komplexet képez: MEDTA^2- (2.22. ábra). Ezt igazolták a kísérleti eredmények is. Ez azt jelenti, hogy a komplexek retenciójának folyamatát az oszlopban csak az anioncsere egyensúlyok szabályozzák, valamint hogy ebben a pH-tartományban a vizsgált komplexek nagyon stabilak, különösen 10 < pH < 11 intervallumban.

Az EDTA ligandum öt formában fordul elő a kísérletekre jellemző pH-tartományban:

EDTA^4-, HEDTA^3-, NaEDTA^3-, NaHEDTA^2- és Na₂EDTA^2-, amelyeket kimutattunk az anioncsere kromatográfiával. Ezt a megállapítást több módszerrel is igazoltuk ionkromatográfiás elválasztással. Változtattuk a mintában a fém:ligandum arányt (2.30., 2.34-2.36. ábra), valamint EDTA-t injektálva az effluensből gyűjtöttük a 6,1–7,4 ill. a 17,7–19,4 min retenciós intervallumban az EDTA^4- / HEDTA^3- és a Na2EDTA^2- frakciókat, 50 °C-on 8 órán keresztül bepároltuk a koncentráció növelése céljából, majd szobahőmérsékleten 8 napig állni hagytuk. A frakciókat a szuppresszoron való áthaladás előtt gyűjtöttük, hogy a komponenseket ne befolyásolja a szuppresszorban megváltozó pH. A két frakciót a gyűjtésre jellemző kísérleti paraméterekkel injektáltuk vissza az ionkromatográfba: eluens: 8,0 mM karbonát/hidrogénkarbonát, pH = 10,27. Az alkalmazott hőmérsékleten az EDTA hőbomlást szenved és a kromatogramon nem beazonosítható bomlástermékek láthatók. A kapott kromatogrammok (2.37. ábra) azonos mintázatúak, csak az intenzitásban van némi eltérés.

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a két EDTA-frakció valóban EDTA-t tartalmazott.

2.37. ábra. Az EDTA injektálásakor gyűjtött frakciók visszainjektálásakor kapott kromatogramok. 1. frakció: EDTA^4- / HEDTA^3-, 2. frakció: Na₂EDTA^2-. Eluens: 8,0 mM

−

−

3 2

3 / HCO

CO , pH = 10,27. A csúcsok az EDTA bomlástermékeit képviselik.

Kísérleti eredményeink alapján elmondható, hogy mind a fém:ligandum arány változtatása, mind a valószínűsített EDTA-csúcsok visszainjektálása azt igazolta, hogy a nagyhatékonyságú anioncsere-kromatográfiával kimutathatók az EDTA ligandum különböző töltésű formái, az elválasztásokhoz alkalmazott eluens pH-jának megfelelő anionok.

2.3.4. A komponenscsúcs-azonosítás helyességének igazolása csatolt