Immunhisztokémiai festések

4.12.1. Általános immunhisztokémiai protokoll

Immunhisztokémiához azidos PBS-ben 4°C-on tárolt 50µm-es, illetve fagyálló folyadékban tárolt 20µm vastag úszó metszeteket használtuk fel, ez utóbbi esetben felhasználáskor először a metszeteket háromszor 10 percig mostuk PBS-ben, hogy eltávolítsuk a fagyálló folyadékot. Az IHC-i festéseket mindig a szöveti endogén peroxidáz aktivitás blokkolásával kezdtük, melyet 3%-os PBS-ben higított H2O2

(Sigma) oldattal végeztünk, 15 percig. A nem specifikus antitest kötődés blokkolására és az antitestek penetrációjának elősegítésére 1 órás 1% BSA-t és 0,5% TritonX-100-at (Sigma) tartalmazó PBS oldatos inkubációt alkalmaztunk. Ezután a metszeteket 2 napig 4°C-on a primer antitestekben inkubáltuk, melyeket a szérumos blokkoló oldattal higítottunk. Ezt követte a PBS-ben hígított szekunder és tercier antitestekben való inkubálás. Az inkubáció ezekben az esetekben szobahőmérsékleten történt 1 órán át.

Végül az immunhisztokémiai festéseket különböző, az adott festéseknél részletezett módon vizualizáltuk. Többes fluorescens jelölések esetén az azonos gazdaállatban termelt primer antitestek egymást követő használatából adódó nem specifikus keresztreakciót citromsavas (Sigma, 0,1M, pH=6,0) oldatban történő hőkezeléssel (Tóth és Mezey 2007), a peroxidáz enzimmel konjugált szekunder, illetve tercier antitestek aktivitását előhívás után 0,1% Na-azidot és 3% H2O2-ot tartalmazó PBS oldattal 20 percig blokkoltuk. Minden egyes inkubációs lépés után a metszeteket háromszor 5 percig mostuk PBS-ben.

35

4.12.2. Fos és nesfatin-1/NUCB2 kettős és Fos, nesfatin-1/NUCB2 és prepro-TRH tripla fluorescens immunfestés

A festést a hideg stressz kísérletből származó (n=3) agymetszeteken végeztük.

Primer antitestként nyúlból származó anti-Fos-t (1:30000, 1. táblázat) használtunk, majd a metszeteket kecskében termelt biotinilált nyúl ellenes szekunder antitestben (1:1000, Vector Laboratories Inc. Burlingame, USA) és extravidin-peroxidáz oldatban (1:1000, Sigma) inkubáltuk. A jelölést tyramide-konjugált FITC-cel (0,01% H2O2-t és 0,1%

FITC-et tartalmazó Tris (0,1M, pH: 8,0) pufferes oldat, Invitrogen) tettük láthatóvá. A második festés alkalmával primer antitestként nyúlból származó anti-nesfatin-1/NUCB2-t (1:12000, 1. táblázat) használtunk, majd a metszeteket kecskében termelt polimer tormaperoxidáz (HRP)-jelölt nyúl ellenes szekunder antitestben (1:3, Millipore, Budapest, Magyarország) inkubáltuk. Ezt a jelölést tyramide-konjugált AlexaFluor 568-cal (0,01% H2O2-t és 0,1% AlexaFluor 568-at tartalmazó Tris pufferes oldat, Invitrogen) hívtuk elő.

Ellenanyag Faj Forrás

Fos Nyúl Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa

Cruz, CA, USA

Nesfatin-1/NUCB2 Nyúl Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Burlingame, CA, USA

PrRP Nyúl Phoenix Pharmaceuticals, Inc.,

Burlingame, CA, USA

TH Egér Millipore, Temecula, CA, USA

Prepro-TRH Nyúl Rédei Éva ajándéka

(Shukla és mtsai 2010)

A tripla jelölés esetében a Fos immunfestés volt az első, és menete megegyezett a fent leírtakkal. Ezt követően a metszeteket nyúlból származó anti-prepro-TRH-ban (1:5000, 1. táblázat) és kecskében termelt polimer HRP-jelölt nyúl ellenes szekunder

1. táblázat: Az immunhisztokémiai festésekhez felhasznált primer antitestek adatai.

36

antitestben (1:3) inkubáltuk. Ezt a jelölést tyramide-konjugált AlexaFluor 568-cal hívtuk elő. A harmadik jelöléshez primer antitestként nyúlból származó anti-nesfatin-1/NUCB2-t (1:12000) használtunk, majd a metszeteket újból kecskéből származó polimer HRP-jelölt nyúl ellenes szekunder antitestben (1:3) inkubáltuk. Ezt a jelölést tyramide-konjugált AlexaFluor 405-tel (0,01% H2O2-t és 0,1% AlexaFluor 405-öt tartalmazó Tris pufferes oldat, Invitrogén) tettük láthatóvá. A metszeteket kezeletlen tárgylemezekre húztuk, majd szárítás után Vectashielddel (Vector) lefedtük.

4.12.3. Nesfatin-1/NUCB2 és prepro-TRH kettős fluorescens immunfestés

Ebben az esetben kolhicin kezelt és kontroll állatokból származó agytörzsi metszeteket használtunk. Primer antitestként nyúlból származó anti-nesfatin-1/NUCB2-t (1:12000) használtunk, majd a metszeteket kecskéből származó polimer-HRP-jelölt nyúl ellenes szekunder antitestben (1:3) inkubáltuk, és a jelölést tyramide-konjugált AlexaFluor 568-cal hívtuk elő. Ezt követően a metszeteket nyúlból származó anti-prepro-TRH-ban (1:5000) és kecskében termelt polimer HRP-jelölt nyúl ellenes szekunder antitestben (1:3) inkubáltuk. Ezt a festést tyramide-konjugált FITC-cel tettük láthatóvá. A metszeteket sejtmagfestő 4’,6-diamino-2-fenilindollal (DAPI) (1:10000, Invitrogen) háttérfestettük, kezeletlen tárgylemezekre húztuk, majd szárítás után Vectashielddel lefedtük.

4.12.4. Fos és nesfatin-1/NUCB2 kettős immunfestés

A festést a restraint stressz kísérletből származó (n=4) agymetszeteken végeztük.

Primer antitestként nyúlból származó anti-Fos-t (1:15000) használtunk, majd a metszeteket kecskében termelt biotinilált nyúl ellenes szekunder antitestben (1:1000) és tercierként alkalmazott extravidin-peroxidáz oldatban (1:1000) inkubáltuk. A jelölést nikkel (Sigma) intenzifikált 3,3’-diamino-benzidin (DAB, Sigma) reakcióval (0,02%

nikkel(II)-szulfát hexahidrátot, 0,02% DAB-ot, és 0,03‰ H2O2-t tartalmazó Tris pufferes oldat) tettük láthatóvá. A második festés ezt követően a fent leírtak szerint történt, azzal a különbséggel, hogy primer antitestként nyúlból származó anti-nesfatin-1/NUCB2-t (1:3000) használtunk, és a reakciót DAB-bal (0,02% DAB-ot és 0,03‰ H2O₂-t tartalmazó Tris pufferes oldat) tettük láthatóvá. A metszeteket zselatinos tárgylemezekre húztuk fel, majd szárítás után DPX-el (Sigma) lefedtük.

37

4.12.5. PrRP és nesfatin-1/NUCB2 kettős és PrRP, nesfatin-1/NUCB2 és TH tripla fluorescens immunfestés

A festéseket két kontroll állat agymetszetein végeztük. Az egyik patkány metszetein a dupla, míg a másikén a tripla jelölést végeztük el. Primer antitestként nyúlból származó anti-nesfatin-1/NUCB2-t (1:20000) használtunk, majd a metszeteket kecskében termelt biotinilált nyúl ellenes szekunder antitestben (1:1000) és extravidin-peroxidáz oldatban (1:1000) inkubáltuk. A jelölést tyramide-konjugált FITC-cel tettük láthatóvá. A második festés alkalmával primer antitestként nyúlból származó anti-PrRP-t (1:10000, 1. táblázat) használtunk, majd a metszeteket kecskében termelt polimer HRP-jelölt nyúl ellenes szekunder antitestben (1:3) inkubáltuk. Ezt a jelölést tyramide-konjugált AlexaFluor 568-cal hívtuk elő.

A tripla jelölés esetében a metszeteket ezek után még egérből származó anti-TH-ban (1:1000, 1. táblázat) és kecskében termelt polimer HRP-jelölt egér ellenes szekunder antitestben (1:2, Millipore) inkubáltuk. Ezt a jelölést tyramide konjugált AlexaFluor 405-tel hívtuk elő. A metszeteket kezeletlen tárgylemezekre húztuk, majd szárítás után Vectashielddel lefedtük.