5. Eredmények
5.5. Az endogen nesfatin-1 szerepe a stressz válasz kialakításában
5.4. A nesfatin-1 közvetlen hatásának vizsgálata a hypophysis sejtekre in vitro
Az előző kísérlet szépen demonstrálta, hogy az exogen nesfatin-1 serkenti a HPA tengely működését, de felmerült a kérdés, hogy ezt közvetlenül a hypophysis sejtekre gyakorolt hatással, és/vagy közvetetten, agyi mechanizmusokon keresztül éri-e el. Méréseink szerint a nesfatin-1 nem befolyásolta a hypophysis sejttenyészetekből történő ACTH felszabadulást, még nagyobb koncentráció alkalmazása esetén sem (25. ábra). Tehát a nesfatin-1 HPA tengely aktiváló hatása nem közvetlenül a hypophysis sejtjein keresztül valósul meg, hanem más útvonalakon keresztül.
5.5. Az endogen nesfatin-1 szerepe a stressz válasz kialakításában
Mivel az exogen eredetű nesfatin-1-nek jelentős hatása volt a HPA tengely hormonjainak termelődésére, megvizsgáltuk, a szervezet által termelt nesfatin-1 részt vesz-e a stressz reakciókban. Az állatokat restraint stressznek vetettük alá, amely egy kevert stressz, vagyis mind fizikai, mind pszichikai komponenseket tartalmaz, és igen szignifikánsan megemeli az ACTH és a kortikoszteron szinteket (Zelena és mtsai 2003).
Ezután megvizsgáltuk, hogy a stressz hatást követően aktiválódnak-e a nesfatin-1/NUCB2 termelő sejtek a stresszválasz közvetítésében fontos területeken, a PVN-ben, a NTS-ban és a VLM-ban. Erős aktivációt tapasztaltunk a parvocellularis PVN medialis szubdivíziójában a restraint hatására, mely terület szorosan köthető a stresszhez. A stresszelt állatokban a nesfatin-1/NUCB2 sejtek 47,0 ± 3,8%-a jelölődött Fos-ra is (26. A,B ábra), míg ez az arány a kontroll állatokban csak 3,9 ± 0,3% volt
25. ábra: A nesfatin-1 hatása a hypophysis sejttenyészetek ACTH termelésére. A nesfatin-1 kezelés nem befolyásolta a hypophysis sejtek ACTH felszabadítását, még nagyobb koncentráció alkalmazása esetén sem. A grafikonokon az adatokat csoportonkénti átlag ± szórásként ábrázoltuk. n=3-4.
56
(26. C ábra). Ugyanakkor a PVN magnocellularis szubdivíziójának nesfatin-1/NUCB2 sejtjei nem mutattak Fos pozitivitást (26. A ábra). Ugyancsak nem találtunk duplán jelölődött sejteket a medulla vizsgált területein a 4 órás restraint stressz után.
A nesfatin-1/NUCB2-t termelő sejtek restraint stresszre adott aktivitás változását nem csak fehérje, de mRNS szintjén is analizálni kívántuk, így a restraintnek kitett állatok metszetein kvantitatív nesfatin-1/NUCB2 ISH-t is végeztünk. A kontroll metszeteken végzett előkísérlet során az antiszensz próba az irodalomban leírtnak megfelelő (Foo és mtsai 2008) jelmintázatot adott, míg a szensz próbával nem detektáltunk jelet (27. A,B ábra).
26. ábra: A nesfatin-1/NUCB2 pozitív sejtek aktivációja a hypothalamicus paraventriculáris magban (PVN) restraint stresszt követően. A nesfatin-1/NUCB2-t termelő sejtek barna, míg a Fos pozitív sejtmagok sötétkék színűek. A: Magas fokú neuronalis aktiváció a PVN medialis parvocellularis szubdivíziójában stresszelt állatban. A magnocellularis sejtek nem reagáltak a stresszre. B: A medialis parvocellularis PVN nagyobb nagyítású képe egy stresszelt állat metszetén. Sok nesfatin-1/NUCB2 pozitív sejt aktiválódott (nyilak). A jobb alsó sarokban lévő kis képen még nagyobb nagyításban láthatóak kettős jelölt sejtek. C: A kontroll állatok metszetein a PVN-ben csak elvétve látni Fos pozitív neuront.
Rövidítések: m: a PVN magnocellularis szubdivíziója, mp: a PVN medialis parvocellularis szubdivíziója, 3V: harmadik agykamra. Mérték: A,C-re vonatkozóan: 100µm, B-re vonatkozóan: 25µm, illetve 8µm a betétképre vonatkozóan. (Könczöl és mtsai 2010)
57
Kísérletünk alátámasztotta, hogy azon felül, hogy a restraint stressz neuronalis aktivációt váltott ki, a nesfatin-1/NUCB2 mRNS expresszióját is megemelte a medialis parvocellularis PVN-ben. Az optikai denzitás 4688 ± 149 volt a kontroll állatok esetében és 5353 ± 210 a stresszelteknél (28. ábra grafikon, n=6, p<0,05). A restraint hatására a nesfatin-1/NUCB2 mRNS megemelkedett mind a hypophyseotrop, mind a pre-autonóm parvocellularis szubdivíziókban (28. A,B,C,D ábra). Továbbá a nesfatin-1/NUCB2 mRNS expresszió a VLM területén is fokozódott (29. B,C ábra). A sejtek feletti átlag szemcseszám 176,1 ± 14,0 volt a kontrollok, és 223,9 ± 12,8 a stresszelt állatok esetében (29. A ábra, n=6, p<0,05). Mindemellett a NTS esetében nem találtunk változást a 4h restraint hatására a nesfatin-1/NUCB2 mRNS expresszióban.
27. ábra: Az általunk készített nesfatin-1/NUCB2 in situ hibridizációs próba verifikálása. A képek a perifornicalis areát mutatják. A: Az antiszensz próbával végzett in situ hibridizáció után az irodalomban leírt mintázatot kaptuk (nyilak). B: A szensz próba esetében nem detektáltunk jelet.
Rövidítések: f: fornix. Mérték: 50µm.
58
A VLM, illetve a NTS területén elhelyezkedő A1 és A2 katekolamin sejtcsoport a stressz információkat közvetítő felszálló pályák fontos állomásai, így érdekelt minket, hogy azok a nesfatin-1/NUCB2 sejtek, amelyek ezeken a területeken találhatók, részei-e
28. ábra: A restraint stressz hatása a nesfatin-1/NUCB2 mRNS expresszióra a hypothalamicus paraventricularis mag (PVN) területén. A legfelső panel: A nesfatin-1/NUCB2 mRNS expresszió számszerűsített adatai kontroll és restraint stressznek kitett állatok esetében. A stressz hatása szignifikánsnak mutatkozott. Az adatokat csoportonkénti átlag ± szórás formátumban adtuk meg, n=6,
*p<0,05. A,B: nesfatin-1/NUCB2 mRNS in situ hibridizációs jel (a fehér pontok az ezüstszemcséket jelenítik meg) sötét látóteres felvételeken bemutatva. A restrain hatására (B) a kontroll állathoz (A) képest a szemcsék denzitása jelentősen megnövekedett a parvocellularis szubdivíziókban. A posterior magnocellularis részt körberajzoltuk, hogy jobban elkülönítsük a PVN parvocellularis szubdivíziójától.
C,D: Világos látóteres képek ugyanazokról a metszetekről, mint az A és B képeken. A Giemsa háttérfestett metszeteken jelöltük a PVN szubdivízióit. Rövidítések: A PVN szubdivíziói: dp: dorsal parvocellularis, pv: periventricularis, pm: posterior magnocellularis, mp: medial parvocellularis, és annak további tagozódása: mpv: pre-autonóm régió, mpdd: dorsalis régió, mpdv: ventralis régió.
Mérték: 250µm. (Könczöl és mtsai 2010)
59
a katekolamin (TH pozitív) sejtpopulációknak. Ennek kiderítése érdekében tripla nesfatin-1/NUCB2, TH és PrRP immunhisztokémiai festést végeztünk, melynek alapján elmondható, hogy a VLM nesfatin-1/NUCB2 pozitív sejtjeinek többsége a katekolamin A1 sejtcsoporthoz tartozik (30. A ábra), továbbá, hogy a NTS-ben lévő neuronok jelentős hányada a nesfatin-1/NUCB2 mellett TH-t is termel (30. B ábra). Ezen felül megállapítottuk, hogy az A1 és A2 sejtcsoport PrRP termelő sejtjei magas arányban kolokalizálnak a nesfatin-1/NUCB2-vel (30. C,D ábra). Ténylegesen az A1 sejtcsoportban a PrRP termelő sejtek 93,42 ± 0,37%-a, míg az A2 sejtcsoport területén a PrRP termelő sejtek 76,59 ± 4,19%-a expresszált nesfain-1/NUCB2-t is.
29. ábra: A restraint stressz hatása a nesfatin-1/NUCB2 mRNS expressziója a ventrolateralis medulla (VLM) területén. A: Az oszlopdiagramm a nesfatin-1/NUCB2 mRNS expresszió számszerűsített adatait mutatja. A restraint hatására szignifikáns emelkedést találunk a kontrollhoz képest. Az adatokat csoportonkénti átlag ± szórás formátumban adtuk meg. n=6, *p<0,05. B,C: A képek a VLM területét mutatják be egy kontroll (B) és egy restraintnek (C) kitett állat metszetén. A nesfatin-1/NUCB2 mRNS in situ hibridizációs jel (fekete pontok) a sejtek felett nagyobb denzitású a (C) képen. A nyilak a jelölt sejteket mutatják. Mérték: 100µm. (Könczöl és mtsai 2010)
60