A nesfatin-1 energialeadásra gyakorolt hatásának vizsgálata

Elsőként azt kívántuk vizsgálni, hogy a nesfatin-1, azon felül, hogy csökkenti a táplálékbevitelt, hat-e az energiaháztartás egyensúlyának másik oldalára, vagyis az energialeadásra. Érdekelt minket az is, hogy a beadott nesfatin-1 milyen hosszan fejti ki a hatását, ezért a biotelemetriás megfigyeléseket két napig végeztük. Az is fontos kérdés volt továbbá, vajon a beadott anyag hatása függ-e az alkalmazás időpontjától (reggel vagy este), vagyis az állat napi ritmusától, aktivitásától. Ezért mind a sötét, mind pedig a nappali ciklus elején terveztünk icv nesfatin-1 kezelést.

A telemetriás transzmitterek segítségével begyűjtött testhőmérsékletre vonatkozó adatok részletes elemzésekor azt tapasztaltuk, hogy az anorexigén nesfatin-1 (25pmol) emelte a patkányok testhőmérsékletét (15. ábra), tehát növelte az energia leadást. Amikor az éjszakai periódus elején kezeltük az állatokat, a testhőmérsékletük azonnal emelkedni kezdett (15. A,B ábra; kezelés hatása: F(1,9)=7,85; p<0,05). A csoportok közötti különbség nem volt annyira kifejezett az éjszakai periódusokban, de igen jelentős volt a nappali időszakokban a megfigyelés 48 órája alatt. A nappali beadást követően az állatok testhőmérséklete mindkét csoportban átmenetileg megemelkedett, ami a passzív periódus megzavarásából adódhatott. A nesfatin-1-et kapott patkányok testhőmérséklete a kezelést követően nagyjából 1,5 órával kezdett enyhén emelkedni (15. D ábra; a kezelés hatása: F_(1,14)=14,2; p<0,01), de ez a növekedés nem maradt szignifikáns a nap folyamán. Az éjszakai periódus alatt a kezelt és kontroll állatok testhőmérséklete továbbra is konvergált, viszont a következő nap a nesfatin-1 kezelt állatok testhőmérséklete szignifikánsan magasabb maradt, ami a csoportok közötti legnagyobb mért különbséget eredményezte. A testhőmérsékletben tapasztalt nagy eltérés a csoportok között megmaradt a következő sötét periódus elején is (15. C ábra). Mind a nappali, mind az éjszakai beadás ellapította a testhőmérséklet cirkadian görbéjét (15. A,C ábra; az idő hatása: F(11,99)=10,4; p<0,01 az esti beadás esetében és F(11,154)=8,25; p<0,01 a nappali beadás esetében), ami főként a nesfatin-1 kezelt állatok nappali magasabb testhőmérsékletéből adódott.

43

Ezek az új észrevételek arra sarkalltak minket, hogy megvizsgáljuk, milyen mechanizmusokon keresztül hathat a nesfatin-1 a testhőmérséklet emelésére. A dolgozatom elején részletesen bemutattam, a szervezet hogyan képes a testhőmérséklet emelésére. Az egyik lehetőség a szimpatikus idegrendszer mozgósítása, mely többek között szívfrekvencia növekedésben nyilvánulhat meg. A 25pmol-os dózisú nesfatin-1-nek nem volt jelentősebb hatása a szívfrekvenciára (16. A-C ábra) egyik kísérletben sem, kivéve egy rövid átmeneti emelkedést nagyjából 1 órával a nappali beadást követően (16. D ábra). A szívfrekvencia a kétnapos megfigyelési periódusban normál cirkadian ritmust mutatott (16. A,C ábra, az idő hatása: F(11,88)=19,7; p<0,01 az esti beadást illetően és F(11,198)=16,7, p<0,01 a nappali beadást illetően). Hogy tisztázzuk, az állatok fizikai aktivitása összefüggésben állhat-e a szívfrekvenciában és a

15. ábra: A nesfatin-1 (25pmol) hatása a patkányok testhőmérsékletére. Az állatok adott időpontban icv nesfatin-1-et, vagy fiziológiás sóoldatot kaptak (nyilak), majd testhőmérsékletüket percenként mértük a telemetriás transzmitterek segítségével. A,C: A 48 órán keresztül detektált, 4 órás periódusokban átlagolt hőméesékleti adatok éjszakai (A) és nappali (C) beadást követően. Az értékeket állatonként, a beadás előtti 6:00 és 7:00 óra között mért testhőmérsékletek átlagához (100%) viszonyítottuk. B,D: A kezelést közvetlenül követő 2,5 óra részletes elemzése esti (B) és nappali (D) beadást követően. Ábrázoláskor ebben az esetben a 10 perces mérések adatait átlagoltuk, és a beadást megelőző 10 percben mért testhőmérsékletek átlagához viszonyítottunk állatonként. A sötét periódusokat a grafikonokon szürke sávok jelzik. Az adatokat átlag ± standard hibaként tüntettük fel, A és C esetében n=5-6, B és D esetében n=8, *p<0,05, **p<0,01. (Könczöl és mtsai 2012).

44

testhőmérsékletben tapasztalt változásokkal, a mozgásra vonatkozó adatokat is a kísérlet teljes 48 órájára vonatkozóan kielemeztük, különös tekintettel a beadást követő 2,5 órára. A rövid idejű, átmeneti szívfrekvencia növekedés nem magyarázza ugyanis a nesfatin-1 hosszú távú testhőmérséklet emelő hatását, viszont a fokozott fizikai aktivitás is vezethet hőmérséklet emelkedéshez. Azonban sem a hosszú távú (17. A,B ábra), sem a rövid távú (17. C,D ábra) elemzést követően nem találtunk szignifikáns különbséget a mozgási aktivitásban.

16. ábra: A nesfatin-1 (25pmol) hatása a patkányok szívfrekvenciájára. Az állatok adott időpontban icv nesfatin-1-et, vagy fiziológiás sóoldatot kaptak (nyilak), majd szívfrekvenciájukat percenként mértük a telemetriás transzmitterek segítségével. A,C: A 48h keresztül detektált, 4 órás periódusokban állatonként átlagolt adatok éjszakai (A) és nappali (C) beadást követően. B,D: A kezelést közvetlenül követő 2,5 óra részletes elemzése esti (B) és nappali (D) beadást követően.

Ábrázoláskor ebben az esetben a 10 perces mérések adatait átlagoltuk állatonként, és a beadást megelőző 10 percben mért szívfrekvencia adatok átlagához (100%) viszonyítottunk. A sötét periódusokat a grafikonokon szürke sávok jelzik. Az adatokat átlag ± standard hibaként tüntettük fel, A és B esetében n=5-6, C és D esetében n=10, *p<0,05, bpm: szívverés/perc. (Könczöl és mtsai 2012)

45

Az irodalmi adatoknak megfelelően, a sötét ciklus elején beadott nesfatin-1 (25pmol/állat) lecsökkentette az éjszakai táplálékbevitel időtartalmát a kezelést követő első 6 órában (18. A ábra) (Oh és mtsai 2006). Megfigyeléseink rámutattak arra, hogy a nesfatin-1 táplálékfelvételt csökkentő hatása hosszú távú, hiszen a táplálékfelvétel időtartama a következő sötét periódus elején is alacsony maradt (18. A ábra, a kezelés hatása: F(1,9)=4,63; p=0,05). A nesfatin-1 a nappali beadás esetében nem hatott azonnal, de meglepő módon az éjszakai táplálékbevitel időtartamát ekkor is mérsékelte (a patkányok éjszakai állatok, a sötét periódusban aktívak, akkor táplálkoznak, nappal alszanak) a megfigyelés ideje alatti két sötét periódusban (18. B ábra, a kezelés hatása:

F_(1,11)=11,9; p<0,01). Mindkét esetben megfigyelhető volt a táplálkozási ciklus

17. ábra: A nesfatin-1 (25pmol) hatása a patkányok lokomóciójára. Az állatok adott időpontban icv nesfatin-1-et, vagy fiziológiás sóoldatot kaptak (nyilak), majd mozgásukat percenként mértük a telemetriás transzmitterek segítségével. A,C: A 48 órán keresztül detektált, 4 órás periódusokban állatonként összegzett adatok éjszakai (A) és nappali (C) beadást követően. B,D: A kezelést közvetlenül követő 2,5 óra részletes elemzése esti (B) és nappali (D) beadást követően. Ábrázoláskor ebben az esetben a 10 perces mérések adatait összegeztük állatonként. A sötét periódusokat a grafikonokon szürke sávok jelzik. Az adatokat csoport átlag ± standard hibaként tüntettük fel, A és B esetében n=5-6, C és D esetében n=10. (Könczöl és mtsai 2012)

46

cirkadian ritmusa (az idő hatása: F(11,99)=10,5; p<0,01, az esti beadás esetében, és F(11,121)=5,83; p<0,01 a nappali beadás esetében), de ennek amplitúdója kisebb volt a kezelt állatoknál, mint a kontrollok esetében (18. A,B ábra, kezelés x idő kölcsönhatás:

F(11,99)=3,06; p<0,01, az esti beadás esetében, és F(11,121)=4,41; p<0,01 a nappali beadás esetében). Ami a 24 óra alatt elfogyasztott táp mennyiségét illeti, azt találtuk, hogy az esti beadást követően csökkent az állatok tápfogyasztása az első napon, majd egy szignifikáns kompenzáció volt megfigyelhető a másodikon (18. C ábra, az idő hatása:

F(1,21)=4,66; p<0,05, kezelés x idő kölcsönhatás: F(1,21)=6,09; p<0,05). A nappali beadások viszont nem hatottak jelentősen erre a paraméterre (18. C ábra).

esti beadás nappali beadás

kezelés 0-24h 24-48h n 0-24h 24-48h n

Táp fogyasztás kontroll 2. 0 ± 1.0 1.6 ± 1.0 5-6 3.5 ± 1.1 2.3 ± 0.8 6 változása (g) nesfatin-1 -1.0 ± 0.9 5.0 ± 1.8^# 6 1.0 ± 0.9 3.2 ± 1.0 6

Víz fogyasztás kontroll 1.8 ± 2.0 2.2 ± 2.4 5 1.5 ± 3.1 3.0 ± 1.4 6 változása (g) nesfatin-1 -12.2 ± 4.5^* 8.2 ± 4.8^# 5 -8.0 ± 3.7^* 8.7 ± 3.8^# 6

Testtömeg kontroll 3.4 ± 2.0 1.6 1.6 2.4 5 6.2 ± 1.7 5.3 ± 1.9 6 változása (g) nesfatin-1 -1.4 ± 2.8 3.0 ± 1.5 5 1.8 ± 0.9 4.7 ± 1.4 6

18. ábra: A nesfatin-1 (25pmol) hatása a patkányok táplálékfelvételére, vízfogyasztására és testsúlyára.

A,B: Az állatok adott időpontban icv nesfatin-1-et, vagy fiziológiás sóoldatot kaptak (nyilak), a mérés folyamatosan történt. A 48 órán keresztül detektált, 4 órás periódusokban állatonként összegzett adatok éjszakai (A) és nappali (B) beadást követően. A sötét periódusokat a grafikonokon szürke sávok jelzik. Az adatokat csoport átlag ± standard hibaként tüntettük fel. A esetében n=5-6, B esetében n=10-12. *p<0,05,

**p<0,01. C: A táp- és vízfogyasztás, illetve a testsúly napi változása az esti és a nappali kezelést követően. A naponta mért táp- és vízfogyasztás adatai közötti eltérést tüntettük fel, melyeket csoport átlag ± standard hibaként adtuk meg, *p<0,05 a kezelés hatását illetően, és ^#p<0,05 az idő hatását illetően.

(Könczöl és mtsai 2012)

C

47

A nesfatin-1 kezelés erőteljesen lecsökkentette a vízfogyasztást az első napon, ezt a vízhiányt a második napon mind a nappali, mind az esti beadás esetében az állatok pótolták (18. C ábra, a kezelés hatása: F(1,9)=6,1; p<0,05, az idő hatása: F(1,21)=5,2;

p<0,05, tendenciával a kezelés x idő kölcsönhatásra F(1,21)=4,8; p=0,056 az esti beadás esetében, és a kezelés hatása az első napon belül p<0,05, az idő hatása: F(1,23)=7,02;

p<0,05, tendenciával a kezelés x idő kölcsönhatásra F(1,23)=4,89; p=0,05 a nappali beadás esetében). A testsúlyváltozások követték a napi táp- és vízfogyasztásnál tapasztalt tendenciákat, de nem érték el a szignifikancia küszöböt egyik esetben sem (18. C ábra).

Farmakológiai szempontból mindig fontos kérdés, hogy az adagolt dózistól függően változik-e egy anyag hatása, így egy következő kísérlet sorozatban egy nagyobb (100pmol/állat) nesfatin-1 dózis hatását vizsgáltuk. A magasabb dózisú nesfatin-1 kezelést a nappali ciklusban végeztük. A hatások ugyanazokat a tendenciákat mutatták, mint a kisebb dózis (25pmol) esetében, de sokszor felerősödtek, vagy előbb jelentkeztek (19. ábra). A kisebb dózis hatásával ellentétben a testhőmérséklet a beadást követően azonnal megemelkedett, a későbbiekben pedig a kisebb dózishoz hasonló lefolyást találtunk: az éjszakai testhőmérsékletek nem különböztek, másnap napközben viszont a kezelés miatt az állatok testhőmérséklete nem hűlt le a normál ritmusnak megfelelően (19. A ábra, a kezelés hatása: F(1,132)=6,45; p<0,05, az idő hatása:

F(11,132)=9,98; p<0,01, a kezelés x idő kölcsönhatása: F(11,132)=5,75; p<0,01). A szívfrekvencia a kisebb dózishoz képest erős emelkedést mutatott a beadást követő rövid időszakban (19. B ábra, az idő hatása: F(11,380)=4,74; p<0,01), de a fizikai aktivitásban ekkor sem találtunk eltérést (19. C ábra).

48

19. ábra: A nesfatin-1 (100pmol) hatása a patkányok egyes telemetriával mért paramétereire. Az állatok adott időpontban icv nesfatin-1-et, vagy fiziológiás sóoldatot kaptak (nyilak), majd paramétereiket percenként mértük a telemetriás transzmitterek segítségével. A,B: A 48h keresztül detektált, 4 órás periódusokban állatonként átlagolt értékek a testhőmérsékletet (A) és a szívfrekvanciát (B) illetően. A testhőmérsékleti adatok esetében az értékeket állatonként, a beadás előtti 6.-7. órában mért testhőmérsékletekhez (100%) viszonyítottuk. C: A kezelést közvetlenül követő 2,5 óra részletes elemzése a lokomócióra vonatkozóan. Ábrázoláskor ebben az esetben a 10 perces mérések adatait összegeztük állatonként. A sötét periódusokat a grafikonokon szürke sávok jelzik. Az adatokat csoport átlag ± standard hibaként tüntettük fel, n=7, *p<0,05, **p<0,01. bpm:

szívverés/perc. (Könczöl és mtsai 2012)

49

B

kezelés 0-24h 24-48h n Táp fogyasztás kontroll 3,6 ± 0,9 1,9 ± 1,3 7 változása (g) nesfatin-1 -4,3 ± 1,8* 4,1 ± 1,1^# 7 Víz fogyasztás kontroll 3,7 ± 1,4 4,0 ± 3,1 7 változása (g) nesfatin-1 -6,9 ± 3,1* 5,7 ± 2,1^# 7 Testtömeg kontroll 0,7 ± 0,9 1,0 ± 1,2 7 változása (g) nesfatin-1 -1,4 ± 2,0 5,1 ± 1,7^# 7

A táplálékbevitel időtartama igen nagy mértékben mérséklődött az első nap éjjelén (20. A ábra, a kezelés hatása: F(1,154)=9,07; p<0,01, az idő hatása: F(11,154)=4,24;

p<0,01, a kezelés x idő kölcsönhatása: F(11,154)=3,12; p<0,01), és ez tükröződött a felvett táplálék napi mennyiségében (20. B ábra). Később egy kompenzációs evés volt megfigyelhető (20. B ábra), mely nagy valószínűség szerint a második világos periódus alatt történt meg (20. ábra, a kezelés hatása: F(1,12)=8,55; p<0,05, tendenciával az idő hatásra: F(11,27)=4,33; p=0,06, a kezelés x idő kölcsönhatása: F(11,27)=9,88; p<0,01). A vízfogyasztásra vonatkozó változások azonosan alakultak a 25pmol és a 100pmol nesfatin-1-el kezelt csoportok esetében (20. B ábra, tendencia a kezelés hatására:

F(1,12)=3,89; az első napon a kezelés hatása p=0,07, idő: F(1,27)=5,29; p<0,05, a kezelés x idő kölcsönhatása: F(1,27)=4,38; p<0,05). A magasabb dózisú nesfatin-1 kezelés sem okozott testsúlyváltozást a kontrollokhoz képest, de felerősítette az előzőleg tapasztalt

20. ábra: A: A nesfatin-1 (100pmol) hatása a patkányok táplálékfelvételére, vízfogyasztására és testsúlyára. A: Az állatok adott időpontban icv nesfatin-1-et, vagy fiziológiás sóoldatot kaptak (nyíl), a mérés folyamatosan történt. A 48h keresztül detektált, 4 órás periódusokban állatonként összegzett adatok nappali beadást követően. A sötét periódusokat a grafikonokon szürke sávok jelzik. Az adatokat csoport átlag ± standard hibaként tüntettük fel. n=7. *p<0,05, **p<0,01. B: A táplálék- és vízbevitel, illetve a testsúly napi változása. A naponta mért táp- és vízfogyasztás adatai közötti eltérést tüntettük fel, melyeket csoport átlag ± standard hibaként adtuk meg, *p<0,05 a kezelés hatását illetően, és ^#p<0,05 az idő hatását illetően. (Könczöl és mtsai 2012)

50

időbeli tendenciákat (20. B ábra, az idő hatása: F(1,27)=5,15; p<0,05, tendencia a kezelés x idő kölcsönhatásra: F(1,27)=4,33; p=0,06).

5.2. A hideg környezet hatása a nesfatin-1/NUCB2 immunpozitív