Az Escherichia coli hidrogenázainak, hidrogén metabolizmusának részletes

Az E. coli a hidrogenáz bioszintézis kutatásainak egyik modellorganizmusa. Négy membránkötött hidrogenáza van, ami szinte egyedülálló a mikrobák között. A 1 és Hyd-2 respirációs folyamatokhoz kapcsolódó hidrogenáz, míg a Hyd-3 és az utoljára, nagy erőfeszítésekkel kutatott Hyd-4 a formát metabolizmushoz kapcsolt s mindkettő egy ún.

formiát-hidrogén-liáz komplex része [Sawers, 1994; Andrews, 1997]. A hidrogenázok poszttranszlációs érési folyamatának jelentős részét a Hyd-3 fehérjén keresztül ismerték meg.

Ahhoz, hogy az E. coli hidrogéntermelő képességét maximalizáljuk, szükséges megismerni az egyes hidrogenázokat, azok bioszintézisének körülményeit, valamint az enzimek fiziológiás szerepét.

Hyd-1 és Hyd-2

A Hyd-1 egy klasszikus hidrogén felvevő enzim, melyet a hyaABCDEF policisztronos operon kódol [Sawers, 1994; Redwood, 2008]. Két struktúrális alegységből, a kis és nagy alegységből áll (HyaAB), amihez egy harmadik transzmembrán citokróm b típusú fehérje kapcsolódik (HyaC). A többi alegység a bioszintézisben játszik szerepet. A felépítésből már valószínűsíthető, hogy a Hyd-1 egy hidrogénoxidáló enzim, amely a H₂ oxidációjából származó elektronokat a CytB segítségével a kinon raktár redukciójára fordítja és végső soron

27

valamilyen terminális elektron akceptorra kerül. Az enzim expresszióját az oxigén és a nitrát is gátolja annak ellenére, hogy az enzim hidrogén oxidációja kapcsolható a nitrát illetve oxigén redukciójához [Laurinavichene, 2001a].

Ez utóbbi széles oxigénkoncentrációs tartományban is működik. Az enzim fiziológiás szerepéről számos javaslat látott napvilágot, egyes kutatások szerint feladata a Hyd-3 hidrogenáz által termelt hidrogén visszaforgatása [Redwood, 2008], mások szerint inkább hidrogén szenzorként funkcionál [Laurinavichene, 2001b]. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a Hyd-1 mindenképpen egy hidrogénoxidáló enzim, a biohidrogén termelésben való szerepe inkább negatív, azonban ezt a képet kicsit megváltoztatta az utóbbi évek azon felfedezése, hogy az E. coli a glicerin fermentálás során képes hidrogént termelni és semleges pH-n ebben a Hyd-1 is szerepet játszhat [Trchounian, 2009].

A Hyd-2 egy bonyolult, egyedi struktúrával rendelkező enzim, melyet a hybOABCDEFG operon kódol [Sawers 1994, Redwood, 2008]. Nemcsak az enzim szerkezete, hanem a gének szerveződése is különleges, ugyanis a kis (HybO) és a nagy (HybC) alegység génje közé két fehérjét kódoló gén ékelődik, melyek valószínűsíthetően egy membránkötött redox-dimer részei. Az enzim, a Hyd-1-hez hasonlóan szintén a hidrogénfelvétel iránya mutat nagyobb aktivitást, a hidrogén oxidációja ebben az esetben is kapcsolható az oxigén és a nitrát redukciójához, igaz az előbbi csak alacsony oxigén parciális nyomás esetén működik. Korábbi elképzelések szerint az enzim fiziológiás szerepe az anaerob respirációs folyamatokhoz kapcsolható, melyek közül is a fumarát, mint terminális elektron akceptor kapott kiemelt szerepet.

Az eddigiek alapján következtetésként elmondható, hogy a Hyd-1 és Hyd-2 hidrogénfelvevő hidrogenázok, a biohidrogén termelésben – cukor fermentálás során – nem tudnak részt venni, jellemzően inkább a formiát-hidrogén-liáz (FHL) által termelt hidrogén visszaalakításában van szerepük. A legújabb kutatások azonban kimutatták, hogy a Hyd-1 illetve Hyd-2 képes semleges pH-n, glicerin fermentáció során hidrogént termelni, a pH csökkentése (pH=5.5), azonban az aktivitásuk megfordulásával jár (3.4.1-3.4.2. ábra) [Trchounian, 2009, 2011, 2012a, 2012b].

Hyd-3 és Hyd-4

A Hyd-3-at a hycABCDEFGHI operon kódolja [Sawers 1994, Redwood, 2008]. A HycG és HycE az enzim kis és nagy alegysége, a HycB és HycF elektrontranszfer alegységek, a HycC és HycD membránfehérjék, a HycH egy hidrofil fehérje, a HycI pedig a

28

poszttranszlációs érésben játszik szerepet. A HycA egy transzkripciós faktor, melynek deléciója megnövekedett hidrogéntermelést eredményez.

A Hyd-3 hidrogenáz működése a formiát-dehidrogenázhoz (FDH-H) kapcsolt és együtt képezik az ún. formiát-hidrogén-liáz (FHL-1) komplexet, mely a formiát oxidációját hidrogéntermeléssel egybekötve katalizálja. A folyamat nem kapcsolódik energiatermeléshez (ATP), sőt mivel hidrogén távozik a rendszerből jelentős energiaveszteséget jelent a sejteknek [Bagramyan, 2002]. A komplex fiziológiás szerepe a sejtek számára toxikus hangyasav (v.

formiát) eltávolítása. Az enzim elsősorban enyhén savas illetve semleges körülmények között mutat aktivitást, de külsőleg hozzáadott formát hatására még alkalikus körülmények között is domináns FHL komplexszé válik.

1997-ben jelent meg a hír, hogy az E. coli rendelkezik egy negyedik hidrogenáz enzimmel (Hyd-4) is [Andrews, 1997], melynek ekkor még csak a génjeit azonosították (hyfABCDEFGHIJR). Az operonnak három új komponense van, ezek a hyfDEF gének, melyek olyan membránkötött fehérjéket kódolnak, melyek hasonlóak a respirációs komplex (NAD-ubikinon-oxidoreduktáz) alegységeihez. Később sikerült olyan aktivitást kimutatni, mely ehhez az enzimhez kapcsolható, és kiderült, hogy ez is egy FDH-H-hoz kapcsolódik, így alkotva egy másik formiát-hidrogén-liáz (FHL-2) enzim komplexet, mely alkalikus körülmények között rendelkezik aktivitással [Bagramyan, 2002]. Ezen felül megállapították azt is, hogy ez az aktivitás ATP szintézishez kapcsolt, tehát egy olyan formiát-hidrogén-liázról van szó, mely képes a sejtek számára energiát (ATP-t) generálni. Az FHL-2 speciális esetben (glicerin fermentáció, savas pH) képes a hidrogén oxidációjára is.

Mindazonáltal világossá vált, hogy még lúgos közegben is az FHL-1 a domináns enzim, amennyiben külső forrásból formiátot adunk a rendszerhez, s így elmondható, hogy az E. coli elsődleges, formiátból hidrogént termelő enzime az FHL-1. Ha glükózt használunk szubsztrátként pepton háttéren, akkor pH=7.5-n a Hyd-3 és a Hyd-2 aktivitása meghatározó: a Hyd-3 hidrogénfejlesztő, míg a Hyd-2 hidrogénoxidáló irányban működik [Trchounian, 2012].

Összefoglalva, kevert savas fermentáció során érdemes olyan törzsekkel dolgozni, melyek a két, respirációhoz kapcsolt, membránkötött hidrogenázt (Hyd-1, Hyd-2) nem, de a formiát-hidrogén-liázokat (FHL-1, FHL-2) tartalmazzák.

29

3.4.1. ábra – Az E. coli H2 termelő és fogyasztó enzimjeinek működése cukor vagy formiát (A) ill. glicerin (B) fermentáció során. A(H₂): a sejtek hidrogéntermelő sebessége; A(Hyd):

az egyes hidrogenázok hidrogéntermelő vagy hidrogénoxidáló sebessége [Trchounian, 2009].

3.4.2. ábra – Az E. coli H₂ termelő és fogyasztó enzimjeinek működése glicerin fermentáció során pH=7.5 (A) és pH=5.5 (B) mellett. VH2: a sejtek hidrogéntermelő sebessége; V(Hyd):

az egyes hidrogenázok hidrogéntermelő vagy hidrogénoxidáló sebessége [Trchounian, 2011].

30