4. Kísérleti rész
4.1. A fermentációs kísérletek során alkalmazott anyagok, eszközök, módszerek
A baktériumtenyészetek fenntartása
Kísérleteim legnagyobb részében E. coli (XL1-BLUE) baktériumtörzset alkalmaztam.
A mikroorganizmus szaporítása agaros Luria-Bertani (LB) táptalajon történt, mely egy általánosan alkalmazott tápközeg az E. coli szaporítására. Összetétele 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat, 10 g nátrium-klorid (és 30 g agar a szilárd táptalaj esetében) 1 L-re vonatkoztatva.
A kísérleti munka során alkalmazott, genetikailag módosított E. coli (DJT 135) törzset Patrick C. Hallenbeck professzor (University of Montreal, Kanada) biztosította, melynek fenntartása a már ismertetett E. coli (XL1-BLUE)-hoz hasonló körülmények között történt.
Ez a mikroba a hidrogénfelvevő hidrogenázok ( Hyd-1, Hyd-2), a laktát-dehidrogénáz enzim ( ldh), valamint a hidrogéntermelésért felelős FHL enzim szabályozásában szerepet játszó fhlA tekintetében hordoz mutációkat. Ezen módosításoknak köszönhetően a baktérium nem képes a megtermelt hidrogén oxidálására (elfogyasztására), glükóz szubsztrát adagolása esetén annak laktáttá alakítása, vagyis ezen kompetitív anyagcsere úton történő katabolizmusa nem mehet végbe, valamint megnövelt FHL enzim expressziós szinttel rendelkezik.
4.1.1. ábra – Az E. coli (XL1-BLUE) Petri-csészében felnövesztve
45 Antibiotikum oldat készítése
A kísérletek során fontos, hogy a rendszert megvédjük az esetleges fertőzésekkel szemben, így a kísérletek során a tápoldathoz minden esetben antibiotikum oldatot adagoltam.
Ezek E. coli (XL1-BLUE) esetében tetraciklin, míg az E. coli (DJT 135) esetében kloramfenikol voltak. Az oldat készítésének menete a következő volt: Az antibiotikumot abszolút etanolban oldva készítettem 5 mg/mL-es törzsoldatot, melyből a későbbiek során a megfelelő mennyiséget mikropipetta segítségével adagoltam a tápoldathoz. A tetraciklin előírt alkalmazási aránya 10 µg/mL tápoldat, míg a kloramfenikolé 20 µg/mL.
Az inokulum készítése
Az inokolumot – másnéven beoltókultúrát – minden kísérletet megelőzően frissen, vagyis előző nap készítettem az agaros LB-táptalajon felnövesztett, szaporított baktériumok felhasználásával. Az átoltásokat steril box alatt dolgozva, aerob körülmények között, előzetesen sterilizált lombikokba végeztem. A lombikok mindegyikét mintegy félig LB szubsztráttal töltöttem fel, melyekhez minden esetben hozzáadtam a megfelelő mennyiségű antibiotikum oldatot, ezt követően a lombikot steril záró kupakkal láttam el és 24 órára 37 o C-on termosztált rázógépbe tettem (rázatási intenzitás 110 rpm). Az inkubálás aerob körülmények között zajlott, a tenyészet ilyen körülmények között gyorsabban nő, így azonban nem termel hidrogént.
Optikai sűrűség (OD620) meghatározása spektrofotométerrel
A kísérletek összehasonlíthatósága miatt fontos, hogy a kiindulási sejtszám jól kontrollálható legyen. Ennek érdekében minden egyes fermentálás előtt mértem a frissen felnövesztett inokulum optikai sűrűségét, s ez alapján számoltam a szükséges beoltó kultúra mennyiségét. Ehhez elsőként hígítási sort készítettem, melyben a sor egyes tagjainak össztérfogata azonos volt, és mindegyik különböző, de ismert mennyiségű inokulumot tartalmazott. Ezt követően spektrofotométerrel mértem az egyes oldatok abszorbanciáját 620 nm-en (OD620) desztillált vízzel szemben, majd a mintákat centrifugáltam (10 perc, 12000 perc-1), végül az oldatokról a tiszta fázist leöntve a kémcsövek alján visszamaradó biomasszát 105 oC-on tömegállandóságig szárítva mértem a hígítási sor minden tagjának szárazanyag tartalmát. A kapott szárazanyag értékek és az ismert oldattérfogatok alapján számítottam a sejtkoncentrációkat (mg sejt szárazanyag (sz.a.)/mL inokulum) majd a hozzájuk tartozó abszorbancia adatokkal együtt ábrázoltuk őket (4.1.2. ábra).
46
4.1.2. ábra – A sejtkoncentráció és az abszorbancia összefüggése A szükséges inokulum mennyiségének számítása 4.1.1. egyenlet szerint történt:
4.1.1. egyenlet: Csejti
* Vi = Csejtt
* (Vi + Vt)
Az egyenlet tulajdonképpen azt adja meg, hogy adott sejtkoncentrációjú (Csejti
) inokulumból mennyit (Vi) kell kivenni és hozzáadni adott (Vt) térfogatú tápoldathoz, annak érdekében, hogy a (Vi+Vt) össztérfogatú fermentlében a kiindulási sejtkoncentráció Csejtt
legyen.
A manometrikus gázmérő készülék
Az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozó fermentációs (elő)kísérleteket WTW OXITOP 100 típusú manometrikus gázmérő készülékben végeztem (4.1.3. ábra), melynek össztérfogata 500 mL volt, melyből a folyadék- és a gázfázis térfogata egyaránt 250-250 mL tett ki. A készülék mérőfeje alkalmas a gáztér nyomásváltozásának mérésére, s a kísérletek során ezt használtam ki, vagyis a zárt rendszerben, a fermentáció során keletkező gáz(ok) nyomásának növekedését mértem.
Az edényekhez a különböző összetételű tápoldatok betöltését követően mágneses keverőszálat adtam, majd a szeptumok és zárókupakok segítségével lezártam. Az így összeállított berendezéseket a tetraciklin oldat steril beméréséhez szükséges pipetta heggyel, az inert gáz steril bevezetéséhez szükséges szűrővel együtt autoklávban sterilizáltam.
47
A környezeti hőmérsékletre visszahűlt rendszerhez – lamináris box alatt – a frissen felnövesztett inokulumból annyit adagoltam, hogy a kiindulási sejtszámok azonosak legyenek.
A kísérletek kezdetén a tápközegek pH-ját 6.5-re állítottam be s a reakcióelegyet 10 percen át inert gáz (nitrogén) steril szűrőn keresztüli bevezetésével öblítettem át annak érdekében, hogy a gázmérő edény gázterében, valamint a folyadékfázisban oldott állapotban jelen lévő oxigént is kihajtsam az anaerob, oxigénmentes körülmények biztosítása érdekében. A készülék mérőfeje nem sterilezhető, így azt etanollal átitatott steril vatta segítségével alaposan megtisztítottam, s csatlakoztattam az üvegedényekhez.. Az ily módon összeállított berendezést 37 oC-os légtermosztátba helyeztem (5.1.1. ábra), s 24 órán keresztül mértem a rendszerben a gázfejlődés hatására bekövetkező nyomásváltozást.
A kísérletek későbbi szakaszában, az E. coli (XL1-BLUE) és E. coli (DJT 135) törzsek összehasonlító vizsgálata során a biorektorként szolgáló gázmérő edényeket az eddig leírtakhoz hasonló módon állítottam össze, azzal a különbséggel, hogy ekkor az üvegeket a kísérleti terv által kijelöltek szerinti pH értékű foszfát pufferrel töltöttem fel (5.5.1 táblázat), melyhez különböző koncentrációkban (5.5.1 táblázat) formiátot, valamint 10 g/L triptont, 5 g/L élesztőkivonatot és 3.33 g/L NaCl-t adtam. Ezen kívül változás volt az is, hogy a gáztérben elhelyezkedő gumikosarában NaOH pasztillákat helyeztem el abból a célból, hogy a fermentáció során keletkező H2 és CO2 tartalmú gázelegyből a CO2 megkötődjön, így a hidrogén keletkezésének folyamatát önmagában nyomon lehessen követni. A készülék gázmintavevő szeptumán vett minták összetételének vizsgálata igazolta, hogy a gáztérben jelenlévő nátrium-hidroxid a keletkező CO2-t hatékonyan adszorbeálta. A manometrikus mérőfej csatlakoztatását követően az edényeket 37 oC-os termosztátba helyeztem, s 24 óráig végeztem a fermentációkat.
4.1.3. ábra – A manometrikus gázmérő készülék
48 A szakaszos üzemű bioreaktor
Az E. coli (XL1-BLUE)-val végzett, szakaszos biohidrogén fermentáció optimalizálását egy laboratóriumi méretű fermentor alkalmazásával végeztem (4.1.4. ábra). A fermentor tulajdonképpen olyan bioreaktor, aminek az üzemeltetési paraméterei (ellentétben a gázmérő készülékkel) kiterjedten ellenőrizhetők és szabályozhatóak. Az előkísérleteket követően célom az optimális paraméterek meghatározása volt a minél hatékonyabb hidrogéntermelő bioreaktor létrehozása érdekében. A biomérnöki laboratóriumunkban használt fermentor egy 3.5 L össztérfogatú, termosztálható, félautomata szabályozású (pH szabályzása automatikus, míg a hőmérséklet és a keverési sebesség manuálisan szabályozható) üvegedény. A fedőlapján kialakított szeptumok, csatlakozók segítségével lehetőség van gáz- és folyadékminta vételre. Szintén a fedőlapon kialakított csonkon keresztül történik a fermentor gáz- és folyadék terének inert gázos (nitrogénes) átöblítése is a kísérletekhez szükséges anaerob körülmények biztosítása érdekében. A mérések előtt az összeállított berendezést minden esetben nyomástesztnek vetettem alá, s csak a tökéletesen záródó rendszerben kapott mérési eredményeket fogadtam el. A kísérletek során a reaktorban a folyadéktérfogat 3100 mL, míg a gáztérfogat 400 mL volt. A fermentlé pH-ját irodalmi adatok alapján 6.5-es értéken szabályoztam, s a reaktor hőmérsékletét 37 oC-ra termosztáltam.
4.1.4. ábra – A szakaszos üzemű fermentor
49 A folyamatos üzemű bioreaktor rendszer
Az E. coli (XL1-BLUE)-val folytatott folyamatos üzemű kísérletekhez – praktikussági okokból – egy 2 L össztérfogatú bioreaktort alkalmaztam. A folyamatos üzemű bioreaktor (4.1.5. ábra) indítása szakaszos üzemmódban kezdődött, melynek célja az volt, hogy az inokulálást követően, a folyamatos üzemmódba történő átváltás előtt a sejteket megfelelő mértékben felszaporítsam. Ennek szellemében a reaktor inokulálását követően a baktériumokat 8 órán keresztül, szakaszos üzemmódban növesztettem a szakaszos kísérletekben optimálisnak talált körülmények alkalmazásával (formiát konc. 30 mM, élesztőkivonat konc.: 5 g/L, tripton konc.: 10 g/L, NaCl konc.: 3.33 g/L, kezdeti sejtkonc.:
0.05 g sejt sz.a./L, keverési sebesség: 220 rpm).
A kezdeti 8 órát követően, amikor a sejtek elérték az exponenciális szakasz végét, egy két munkahelyes perisztaltikus pumpa segítségével elindítottam a friss tápközeg betáplálását az adott tartózkodási időnek megfelelő áramlási sebességgel (mL/h), s ezzel szimultán, azonos sebességgel az elhasznált tápközeg reaktorból történő elvételét. A folyamatos üzemű kísérletek az adott tartózkodási idő mintegy 4.1-4.2 szeresét kitevő ideig tartottak. A kísérletek során a reaktor folyadékterének térfogata konstans 1000 mL, míg a gáztérfogat a csatlakozó csövekkel együtt 1100 mL voltak. Az előzetesen sterilizált, friss tápleves egy külső, 4.5 L hasznos térfogattal rendelkező tartályból került betáplálásra, melynek összetétele az alábbiakban adható meg: formiát konc. 30 mM, élesztőkivonat konc.: 5 g/L, tripton konc.:
10 g/L, NaCl konc.: 3.33 g/L. A képződő gázelegy hidrogéntartalmát on-line módon, a BlueSens hidrogénszenzor használatával mértem, melyhez egy gázrecirkulációs ágat alakítottam ki a rendszerben. A szenzor mintavételi frekvenciáját 1 h-1-ra állítottam. A kísérletek alatt a fermentlé pH-ját 6.5-es értéken szabályoztam, a hőmérsékletet 37 oC-ra termosztáltam.
50
4.1.5. ábra – A folyamatos üzemű hidrogéntermelő bioreaktor rendszer
1: Fermentor; 2,3: sav- ill. lúgtartály; 4: pH szabályzó; 5: sav- ill. lúg adagolópumpa; 6:
gázmennyiség mérő („kotyogó”); 7: keverő; 8,9: BlueSens gázanalizátor; 10: gázrecirkulációs pumpa; 11: betáp tartály; 12: elfolyó tartály; 13: betáp-elvét pumpa; 14: termosztát; 15: PC
A keletkező gáz összetételének meghatározása GC-vel
A szakaszos üzemű fermentorban végzett kísérletek során a képződött gázelegy hidrogén tartalmát gázkromatográfiás módszerrel határoztam meg, amelyhez GOW-MAC Series 600 típusú gázkromatográfot használtam. Az analízishez hélium vivőgázt (30 mL/min), egy 2 m hosszú, zeolit töltetes kolonnát, illetve hővezetőképességi detektort (TCD) alkalmaztam.
A keletkező gáz összetételének meghatározása BlueSens hidrogénszenzorral
A folyamatos rendszerben végzett biohidrogén fermentációk során keletkezett gázelegy hidrogéntartalmának mérését, valamint a kevert gázzal végzett membrán szeparációs vizsgálatok során a betáp, a permeátum és retentátum áramok hidrogén koncentrációjának nyomonkövetését on-line módon, a BlueSens (BlesSens Gas Sensor GmbH) hidrogénszenzor használatával végeztem (4.1.6. ábra).
51
Ez a készülék képes a többkomponensű gázelegyek hidrogén tartalmának real-time módon történő meghatározására 0-100 %(V/V) koncentráció tartományban, két tizedes pontossággal, minimálisan 20 s-os válaszidő alkalmazása mellett.
4.1.6. ábra – A BlueSens hidrogénszenzor A keletkező gáz mennyiségének mérése
A keletkező biogáz mennyiségének mérése egy módosított U-cső („kotyogó”) segítségével történt, melynek bal és jobb oldali szára között egy átvezető csőszakasz helyezkedett el. A módosított U-cső mindkét szárába egy-egy fémdrótot vezettem be, majd csapvízzel töltöttem fel a készüléket. A bal szárban lévő elektród folyamatosan érintkezett a vízzel, míg a jobb oldali elektród alapesetben szárazon volt (nyitott állás). A bal oldali rész felül zárt (felső harmadán lévő csonk segítségével csatlakozott a fermentorhoz), míg a jobb oldali szár felül nyitott kialakítású volt. A biohidrogén fermentáció során keletkező gáz az U-cső bal szárában folyamatosan szorította ki a folyadékot, mellyel párhuzamosan az átvezető csőszakaszban és az U-cső jobb szárában emelkedett a vízszint. Abban a pillanatban, amikor a folyadék szintje a jobb oldalon is elérte az elektródot, az áramkör zárult (zárt állás). Amikor a keletkező gáz az átvezető csőszakaszból teljesen kinyomta a vizet, a nyomáskülönbség a két szár között kiegyenlítődött, a jobb oldali elektród ezzel ismét szárazra került, vagyis nyílt az áramkör [Szentgyörgyi, 2010]. A nyitott és zárt állapotok közötti változás egy jelet generált, amit multiméter segítségével mértem. A nyitott-zárt-nyitott ciklusokat „kotyogásnak”
neveztem el. A „kotyogás” térfogatát a mérés előtt kalibráltam, így a kotyogások számából (amelyet a multiméterhez kapcsolt számítógép segítségével regisztráltunk) a kumulált gáztérfogat számolhatóvá vált. A „kotyogó” fényképe a 4.1.7. ábrán látható.
52
4.1.7. ábra – A „kotyogó” fényképe
A keletkező biohidrogén mennyisége a fermentáció során keletkező gázelegy össztérfogatából (kotyogások száma) és a fermentor gáztér összetételének időközönkénti analíziséből számítottam a 4.1.2. egyenlet szerint:
4.1.2. egyenlet: VHi
= V0(CHi
- CHi-1
) + CHi
(VGi
- VGi-1
)
ahol VHi az (i) időintervallum alatt keletkezett hidrogén mennyisége (mL); V0 a bioreaktor gázterének térfogata (mL); CHi a hidrogén gázfázisbeli koncentrációja (i) időpontban (%(V/V)); CHi-1 a hidrogén gázfázisbeli koncentrációja (i-1) időpontban (%(V/V)); VGi
az (i) időintervallum alatt keletkezett gáz mennyisége (mL); VGi-1
az (i-1) időintervallum alatt keletkezett gáz mennyisége (mL).