5. Eredmények és értékelésük
5.4. Biohidrogén fermentáció folyamatos rendszerben
Az eddigi eredmények alapján elmondható, az E. coli (XL1-BLUE) anaerob körülmények között, szakaszos bioreaktorban hidrogén előállításra képes. A szakaszos rendszerben végzett méréseket és a baktérium növekedésének kinetikai vizsgálatát követően, a célom az volt, hogy a mikroba felhasználásával tanulmányozzam a hidrogén fermentáció megvalósíthatóságát folyamatos körülmények között. A vonatkozó kísérleteket folyamatos, tökéletesen kevert reaktorban (CSTR – Continuously Stirred Tank Reactor) végeztem, ahol is a folyamatos rendszerek egyik legfontosabb paraméterének, a hidraulikus tartózkodási időnek (HRT) a hidrogénképződés folyamatára gyakorolt hatásának vizsgálatát és optimális értékének meghatározását tűztem ki célul. Ismereteim szerint az általam alkalmazni kívánt stratégia, vagyis a hidrogéntermelés számára megfelelő HRT-nek a mikroba növekedési kinetikája alapján történő kiválasztása újszerű, eddig még nem alkalmazott módszer. A szuszpendált, szabadsejtes CSTR rendszerben a hidraulikus tartózkodási idő, valamint a biomassza tartózkodási idő megegyezik, vagyis a kettő nem függetleníthető egymástól, következésképpen olyan tartózkodási időt célszerű alkalmazni, mely lehetővé teszi a sejtek biokatalitikus aktivitásának minél nagyobb mértékű fenntartását. Az előző fejezetekben végzett mérések eredményei megmutatták, hogy egyrészt a gáztermelés és a sejtszaporodás egymással szorosan összefügg (5.2.4. ábra), másrészt kiderült az is, hogy a legrövidebb generációs idő, vagyis az exponenciális szaporodás szakasza 5-7 óra között található. Továbbá irányadó érték az is, hogy 2.6 órás minimális tartózkodási időt kell biztosítani ahhoz, hogy a sejtek fermentorból való kimosódása elkerülhető legyen.
A szakirodalomban fellelhető adatok szerint az E. coli-ban található hidrogenázoknak különböző indukciós fázisai vannak [Sawers, 1994]. Ezen felül Kim és munkatársai vizsgálatokat végeztek az E. coli-hoz nagyon hasonló hidrogenáz enzimrendszerrel rendelkező fakultatív anaerob baktériumon [Kim, 2008]. Ennek során megállapították, hogy a hidrogéntermelésért felelős enzimek aktivitása a sejtszaporítás kezdetétől gyorsan növekszik, s az exponenciális növekedés szakaszában maximumot ér el, míg ezzel ellentétben a hidrogénoxidációért felelős enzimek aktivitása időben lassabban növekszik, s maximális értéke az exponenciális növekedési szakaszon túl, a stacioner szaporodási fázisban mutatkozik. Az eddigieket összegezve következik, hogy a folyamatos üzemvitel során olyan hígítási sebességet ajánlatos beállítani, mely nem teszi lehetővé a rendszerben lévő sejtek számára az exponenciális szakaszon túl történő növekedést, tehát a hidrogéntermelő enzimek
71
megfelelő aktivitásának fenntartásához a kinetikai vizsgálatok eredményei alapján a hidraulikus tartózkodási idő becsült, optimális értéke 7 óra. Ennek vizsgálatára kísérleteket végeztem különböző hidraulikus tartózkodási idők (5 h, 7 h, 9 h) beállítása mellett, melyek közül a kinetikai vizsgálatok alapján az első kettő az exponenciális szaporodási szakaszhoz, míg az utóbbi pedig a sejtnövekedési görbe stacioner fázisához tartozik. A fermentáció során mért eredményeket, a kapott adatokat az 5.4.1.-5.4.3. ábra reprezentálja.
Az 5.4.2. ábra a folyamatos rendszerben, különböző hidraulikus tartózkodási idők mellett végzett hidrogén fermentációk során mért hidrogénképződési sebességek időbeli változását mutatja. Az ábra alapján a folyamat 3 főbb szakaszra bontható:
1. szakasz (0-8 óra): szakaszos üzemmód, melynek célja az, hogy a mikroorganizmusokat a megfelelő mértékben felszaporítsuk a folyamatos üzemvitelre való átállás előtt.
2. szakasz (9-15 óra): a 8. óra végén történik a bioreaktor folyamatos üzemmódba való kapcsolása, vagyis megkezdődik az adott tartózkodási időnek megfelelő mértékű friss tápoldat beadagolása és az azzal ekvivalens mennyiségű elfolyó elvétele. Ahogy az ábrán látható, ebben az időszakban valamiféle tranziens állapot valósul meg, hiszen elsőként 9-12 óra között az alkalmazott HRT értékétől függetlenül meredek csökkenés, majd a 13-15 óra között meredek növekedés látható. Ez valószínűleg annak tudható be, hogy az E. coli baktériumnak adaptálódni kellett a megváltozott körülményekhez.
3. szakasz (16. órától): minden HRT esetében erősen csökken a hidrogénképződés sebessége. Ennek vizsgálatára vonatkozó eredményeimet a későbbiekben, az 5.4.1.
táblázatot követően részletezem.
72 0
10 20 30 40 50
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
H
2k o n c. % (V /V )
Idő (h)
5 h 7 h 9 h
5.4.1. ábra – A gázfázisbeli hidrogénkoncentrációk alakulása az egyes HRT-k esetében
0 10 20 30 40 50 60 70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
H
2ké p ző dé si s eb es sé g (m L /h )
Idő (h)
5 h 7 h 9 h
5.4.2. ábra – A mért hidrogénképződési sebességek az egyes HRT-k esetében
73 0
200 400 600 800 1000 1200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
K um ul at ív H
2te rm el és (m L )
Idő (h)
5 h 7 h 9 h
5.4.3. ábra – Kumulatív hidrogénképződés az egyes HRT-k esetében
Az első 8 óra adatainak, vagyis a mikroorganizmus kellő mértékű felszaporítása, a bioreaktor szakaszos üzeme során kapott adatok kiértékeléséből látható, hogy az egyes lefutások jó egyezést mutatnak, amely a mérés megfelelő reprodukálhatóságát mutatja. A folyamatos biohidrogén termelés hatékonyságának megítélése, a különböző üzemállapotok során kapott eredmények összehasonlítása érdekében számítottam mind a fajlagos képződési gázáramok, mind pedig a hozamok értékeit, melyek az 5.4.1. táblázatban láthatók.
5.4.1. táblázat – A HRT biohidrogén képződésre gyakorolt hatásának értékelése
HRT (h)
5 7 9
szakaszos 8 8 8
folyamatos 21 29 37
Ciklusok száma folyamatos üzemmódban 4.2 4.15 4.1
Keletkezett hidrogén (mmol) 27 40 36
Összesen hozzáadott formiát (mmol) 156 155 153
Hozam (mmol H2 mmol-1 formiát) 0.17 0.26 0.23
Fajlagos képződési gázáram (mmol H2 L-1d-1) 4.3 5.1 3.8 Működési idő (h)
74
A táblázatból kiolvasható, hogy a legmagasabb értékeket mindkét paraméter esetében HRT= 7 óra esetében sikerült elérni, ekkor a fajlagos képződési gázáram 5.1 mmol H2 L-1d-1, míg a hozam 0.26 mmol H2/mmol formiát voltak. Az eredmények alapján elmondható, hogy 7 órás hidraulikus tartózkodási idő beállítása optimális a hidrogéntermelés szempontjából. Ez alátámasztja azt a hipotézist, mely szerint az exponenciális szaporodási szakasz végére vonatkozó időtartam tartózkodási időként, folyamatos rendszerben való alkalmazása növeli a hidrogéntermelés hatékonyságát.
Mindamellett, hogy HRT=7 óra esetén sikerült a legjobb eredményeket elérni, a folyamatos rendszer hatékonysága alulmúlta a szakaszos rendszerben mért gázképződési és hozam értékeket, s megkíséreltem kideríteni, mi állhat ennek hátterében.
Elsőként optikai sűrűség mérésével vizsgáltam a fermentlében a baktérium populációt, s azt tapasztaltam, hogy az idő múlásával a mért értékek nem a vártak szerint alakultak, vagyis nem állt be egy kvázi stacioner állapot, ezzel szemben a mért optikai denzitás értéke az idővel folyamatosan nőtt. Ebből arra következtettem, hogy talán autolízis történhet, vagyis a sejtek elhalása egyre nagyobb mértéket ölt. A sejtek elhalásának további vizsgálatára a folyadékfázisból időközönként mintát véve fluoreszcens mikroszkópos felvételeket készítettem, amellyel az élő, vagyis aktív (kék) és az elhalt, inaktív (piros) sejtek szín alapján elkülöníthetők (5.4.4-5.4.7. ábra).
5.4.4. ábra – 15 h (HRT= 7h) 5.4.5. ábra – 20 h (HRT=7 h)
75
5.4.6. ábra – 25 h (HRT=7 h) 5.4.7. ábra – 30 h (HRT=7 h) A felvételekről az látszik, hogy az idő előre haladtával egyre nagyobb számban jelentek meg a pirossal látható elhalt sejtek, következésként elmondható, hogy a hidrogén termelés visszaesésének oka feltehetően a sejtek egyre jelentősebb pusztulása volt. Azt, hogy a sejteket miért nem sikerült megfelelően életben tartani, egyenlőre még nem sikerült kideríteni.
5.5. Az Escherichia coli (XL1-BLUE) és (DJT 135) baktériumtörzsek hidrogéntermelésének összehasonlítása
Ahogy az irodalmi részben ismertettem, a biohidrogén sötét fermentációs eljárással való előállítása attraktív lehetőség, mindemellett az ilyen rendszerek többségében csupán alacsony hozamok (mol H2/mol szubsztrát) elérését teszik lehetővé. Következésképpen ahhoz, hogy ezek a megoldások ipari és gazdasági szempontokat figyelembe véve idővel versenyképesek lehessenek, a szubsztrát konverziós hatékonyságot célszerű növelni. Erre megfelelő stratégia lehet a metabolikus mérnökség adta lehetőségek kihasználásával megnövelt hidrogéntermelő potenciállal rendelkező mutáns törzsek létrehozása, s az ily módon megnövelt hidrogéntermelő képesség realizálása a fermentáció optimális körülményeinek meghatározásával. Az ilyen megközelítésben rejlő lehetőségek demonstrálására kísérlettervezést alkalmazva összehasonlító vizsgálatokat végeztem a vad-típusú E. coli (XL1-BLUE), valamint a genetikailag módosított E. coli (DJT 135) törzs hidrogéntermelésével kapcsolatosan. Mindkét törzsre vonatkozóan Statistica 8 segítségével egy 32 típusú teljes kísérleti tervet készítettem (5.5.2. táblázat), amelyben a pH és a formiát koncentráció hatását a hozam értékek tükrében vizsgáltam a manometrikus gázmérő
76
készülékben. Ezzel a típusú kísérleti tervvel lineáris, négyzetes kapcsolatok, valamint az egyes változük között esetlegesen fennálló kölcsönhatások is vizsgálhatók.
Az illesztett modell:
a független változók (pH, formiát koncentráció) négyzetes hatásai, X1 és X2 a független változók lineáris hatásai, míg X1X2 a független változók kölcsönhatása; b11 és b22 négyzetes, b1 és b2 lineáris, míg b12 kölcsönhatás együttható; Y0: ordináta metszet.
Cél volt az is, hogy a formiát koncentráció optimumára vonatkozóan megerősítő kísérleteket végezzek, valamint hogy információt kapjak a reakció valódi pH optimumára vonatkozóan. tartalmazza. Ahogy látható, mindkét baktérium törzs esetében összesen 12 kísérlet végeztem, melyek tartalmaztak 3-3 középpontbeli ismétlést. A keletkezett hidrogén mennyiségét (mmol) a mért hidrogénnyomásokból az ideális gáztörvény alapján számoltam. A fermentációk időbeli lefutását az 5.5.1-5.5.2. ábrák reprezentálják.
5.5.2. táblázat – A kísérleti terv az eredményül kapott hozam értékekkel
Kísérleti beállítás pH Formiát konc. (mM)
77
5.5.2. ábra – Hidrogénképződési lefutások az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan
0
5.5.3. ábra – Hidrogénképződési lefutások az E. coli (DJT 135)-ra vonatkozóan
78
Az elvégzett statisztikai kiértékelés (ANOVA) alapján az illesztett modell mindkét esetben megbízhatóan írja le a hidrogénképződést (XL1-BLUE: R2 = 0.996; DJT 135: R2 = 0.994).
5.5.3. táblázat – Az egyes faktorok hatásai a hidrogénképződésre
E. coli (XL1-BLUE) E. coli (DJT 135) Faktor
pH 0.02582 0.018
Formiát konc. <0.0001 <0.0001
pH x Formiát konc. 0.1622 0.6065
Szignifikancia (α)
Ahogy az 5.5.3. táblázatban látható, mind a pH, mind pedig a formiát koncentráció szignifikánsan (α<0.05) befolyásolta a hidrogénképződés folyamatát. Ezen felül az is látszik, hogy a szubsztrát koncentráció hatása nagyobbnak bizonyult a pH hatásánál. Az 5.5.3. ábra példaként az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan szemlélteti a mért és az illesztett modell által számított hozam értékek közötti korrelációt, melyek között szoros egyezés mutatkozik, amely az illesztett modell megbízhatóságát tükrözi.
5.5.4. ábra – A mért és az illeszett modell által számolt értékek közötti korreláció az E. coli (XL1-BLUE)-ra vonatkozóan
79
Az egyes E. coli törzsekre vonatkozó, a pH és a formiát koncentráció hozamra gyakorolt hatását az 5.5.4. és 5.5.5. ábrák reprezentálják. Ahogy az megfigyelhető, mindkét felületnek jól kivehető szélsőértéke van, vagyis a maximális hozam a faktorok vizsgálati tartományán belül érhető el.
5.5.5. ábra – A pH és formiát koncentráció hatása a hozamra E.coli (XL1-BLUE) esetében Ahogy az 5.5.4. és 5.5.5. ábrák alapján megállapítható, az elérhető hozam értéke mindkét törzs esetében növekedett, az E. coli (XL1-BLUE) esetében maximum 29 mM, míg az E. coli (DJT 135) esetében 28 mM formiát koncentrációnál adódott. Ezen értékek felett mindkét esetben erős csökkenés mutatkozott, mely feltehetően a szubsztrát inhibíció következménye.
80
5.5.6. ábra – A pH és formiát koncentráció hatása a hozamra E.coli (DJT 135) esetében Ahogy az 5.5.2. táblázatban megfigyelhető, zérus kiindulási formiát koncentráció alkalmazásakor egyik baktérium esetében sem tapasztaltam hidrogénfejlődést. Ez alátámasztja a már ismertetett irodalmi adatokat, miszerint E. coli esetében a fehérjékből nem keletkezik hidrogén. A pH optimum tekintetében kapott optimum értékek jó egyezést mutatnak a korábban a szakirodalomban közölt s a kísérleti munka megelőző részéhez adaptált pH=6.5 értékkel. Az egyes törzsekre vonatkozó optimális pH és formiát koncentráció értékek, valamint a hozzájuk tartozó hozam értékek az 5.5.4. táblázatban láthatók.
5.5.4. táblázat – Az optimális fermentációs körülmények
pH Formiát konc. (mM) Hozam (mol H2/mol formiát)
E. coli (XL1-Blue) 6.4 29 0.42
E. coli (DJT 135) 6.5 28 0.63
Az 5.5.4 táblázatból kiolvasható, hogy a metabolikus mérnökséggel létrehozott E. coli (DJT 135) törzs optimális feltételek mellett az E. coli (XL1-BLUE)-hoz képest mintegy 50%-kal magasabb hozam elérését tette lehetővé.
81
Ezen felül, az E. coli (XL1-BLUE)-ra kapott optimális kondíciók és a hozzátartozó maximális hozam jó egyezést mutat a fermentáció korábban meghatározott optimális viszonyaival, tehát megerősíti azokat (formiát konc.: 30 mM, pH=6.5, hozam: 0.41 mol H2/mol formiát).
A kapott eredmények rámutattak arra, hogy a hidrogéntermelő baktériumok speciális módosítása jelentős mértékben képes a hidrogén előállítás hatékonyságának növelésére, azonban a potenciálok maximális realizálásához mindenképpen szükséges a fermentációs paraméterek optimalizálása, vagyis a két módszer kombinálása lehetőséget adhat a kellően hatékony hidrogéntermelő bioreaktorok kialakításához.
Az 5.5.5. táblázatban a jelen dolgozat, valamint más, szakirodalomban található publikációk eredményeinek az összehasonlítása látható.
5.5.5. táblázat – Különböző Enterobacteriaceae baktériumokkal, formiát szubsztráton megvalósított biohidrogén fermentációk eredményei
Mikroorganizmus H2 FKG Hozam Megjegyzés Referencia
Escherichia coli (XL1-BLUE) 426 mL L-1d-1 0.42 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos jelen dolgozat Enterobacter asburiae (SNU-1) NM 0.43 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos Shin, 2007
*Escherichia coli (DJT 135) NM 0.63 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos jelen dolgozat
*Escherichia coli (SH5) 2400 mL L-1h-1 NM immobilizált, rátáplálásos Seol, 2011
*Escherichia coli (BW25113) NM 1.2 mol H2/mol formiát szabadsejtes, szakaszos Maeda, 2007
*Escherichia coli (SR13) 300 L L-1 d-1 NM szabadsejtes, folyamatos Yoshida, 2005
*: metabolikusan áttervezett törzs térfogata, hőmérséklet, membrán felülete) paraméterek alapján számítottam a következőket:
tartályban uralkodó nyomás, a membránon átpermeált gáz mennyisége, amelyből számíthatóvá vált a permeabilitás (a membrán egységnyi felületén egységnyi idő alatt áthaladó gáz mennyisége a nyomásváltozás adatok alapján) GPU-ban megadva. A gáztartályban uralkodó nyomásviszonyok, valamint a permeációs gázáramok időbeli változását az 5.6.1. ábra demonstrálja.