Biokémikai és immunhisztokémiai módszerek

10.1.10.1. APP és PKC szemikvantitatív meghatározása Western immunoblottal A transzgenikus egerek és a pszichofarmakon oltott patkányok máj- és agymintáit teflon-üveg homogenizátorban homogenizáltuk proteáz gátlókkal kiegészített TRIS pufferben. Az agyminták esetében a homogenátumokat 100 000 g-vel 30 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A keletkezett felülúszó frakciót „szolubilis” frakcióként kezeltük a továbbiakban. A szolubilis és membrán kötött frakciók megkülönböztetésének az APP és PKC immunoblot eredmények értékelése szempontjából van jelentısége. Az üledéket 1% SDS-t és proteáz gátlókat tartalmazó TRIS pufferben szuszpendáltuk fel újra és az elızı centrifugálási lépést megismételve mostuk.

A keletkezett felülúszó frakciót „membrán” frakciónak tekintettük a további immunoblot kísérletekben.

Az agyi BACE tartalom mérése során nem különítettünk el szolubilis és membrán kötött frakciókat. A minták fehérje tartalmát Lowry és mtsai (1951) módszere szerint határoztuk meg.

A 25 µg fehérje tartalmú mintákat 9%-os poliakrilamid gélen futtattuk, a szétválasztott fehérjéket pedig nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A membránokat APP ellen termelt monoklonális antitesttel (22C11, Boehringer Mannheim, Németország) inkubáltuk egy éjszakán keresztül. Az APP vizsgálatok esetében a másodlagos antitest (HRP jelölt egér ellenes birka IgG, Sigma, USA) volt, amellyel egy órán át inkubáltunk. A PKC ellenanyag szintén monoklonális volt, a BACE esetében pedig poliklonális ellenanyagot használtunk. Ez utóbbinál HRP jelölt nyúl ellenes kecske IgG került felhasználásra. A munkafázisok közötti mosások 0.2%

Tween-20-at tartalmazó 0.1 M TRIS puffer - 0.9% NaCl-ban történtek, rázógéppel, 5x5 percig.

Az immunoblot reakciót Supersignal West Pico kemilumineszcens reagensben (Pierce, USA) történt 5 perces inkubációval és 1 perces röntgenfilmre történı hívással tettük láthatóvá. A csíkokat denzitometriával kvantifikáltuk.

_____________________________________________________________________________________________

10.1.10.2. Elektroforetikus mobilitási shift vizsgálatok (EMSA)

10.1.10.2.1. A nukleális fehérje kivonat készítése

A koleszterin diétán tartott nyulak agyából a nukleális fehérje preparátumot Yan és mtsai (1995) módszerével készítettük. Az agymintákat 7.9-es pH-jú HEPES oldatban − amely 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10% glicerol, 1 mM DTT és 0.5 PMSF-et tartalmazott − teflon-üveg homogenizátorral homogenizáltuk 10 fel-le húzással és 15 percig jégen inkubáltuk. 3ml 10%-os NP-40-et adtunk a szuszpenzióhoz és röviden vortexeltük. A sejtmagokat centrifugálással választottuk el (4000 g, 5 perc, 4 °C-on). A nukleuszokat tartalmazó üledéket 70 µl puffer D-ben szuszpendáltuk (20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM EDTA, 20%

glicerin, 1 mM DTT, 0.5 mM MPMSF). A szuszpenziót 4 °C-on 20 percig inkubáltuk, majd 8000 g-vel 5 percig centrifugáltuk. A felülúszó tartalmazta a nukleális protein preparátumot, amelynek fehérje tartalmát Detergent Compatable Protein Assay Kit segítségével határoztuk meg (BioRad, USA). Borjú szérum albumint használtunk standardként.

10.1.10.2.2. EMSA

Az EMSA vizsgálatokban az NF-κB molekula DNS kötı szekvenciáját tartalmazó kettıs szálú oligonukleotidot használtunk a transzkripciós faktor DNS kötı képességének mérésére. A használt szekvenciája a következı volt: -AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'-(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Az aláhúzás az NF-κB-t kötı szekvenciát jelöli. Az EMSA mérést Andrews és mtsai (1991) módszere szerint végeztük. Röviden: 50 ng kettıs szálú NF-κB-kötı oligonukleotidot [g-32P]-ATP (NEN) jelöltünk a végein T4 polinukleotid kináz segítségével, és a jelölt próbákat etanol kicsapással tisztítottuk meg. A DNS kötési reakcióhoz használt oldat a következıket tartalmazta: 10 µg nukleáris protein kivonat, 10 mM TRIS (pH 7.6), 60 mM NaCl, 1 mM DTT, 4 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 6 fmol ³²P-jelölt oligonukleotid (kb. 20 000 cpm-nek megfelelı érték) és 5% glicerin 20 µ l végtérfogatban. A reakcióelegyet nem-jelölt oligonukleotidok hozzáadásával, és anélkül is, 20 percig 37 °C-on inkubáltuk. A mintákat 4%-os natív poliakrilamid gélen elektroforézissel választottuk el. Az izotóp-kötéssel jelölt fehérjéket a szárítás után autoradiográfiával tettük láthatóvá a géleken. A jelölés erısségét lézer denzitometriával kvantifikáltuk és relatív arányokat számítottunk, amelyeket relatív egységekben fejeztünk ki.

Az AP-1-et kötı kettıs szálú oligonukleotid szekvenciája a következı volt: 5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3’ (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). A transzkripciós faktor-kötı szekvenciát ebben az esetben is aláhúzással jelöltem. Az EMSA méréseket az

NF-κB-EMSA mérési módszeréhez hasonlóan végeztük az AP-1 esetében.

10.1.10.3. Az AChE és BChE enzimek aktivitásának meghatározása

AChE és BChE aktivitás meghatározását Ellman és mtsai (1961) spektrofotometriás módszerével határoztuk meg. Szubsztrátként acetiltiokolint vagy butiriltiokolint használtunk. Az AChE-t specifikus BChE inhibítor (ethopropazin 10^-4 M), a BChE-t pedig specifikus AChE inhibítor jelenlétében (1,5 bis(allildimetilammoniumfenil)pentán 3-dibromid, BW284c51, 10^-5 M) mértük.

10.1.10.3.1. Az AChE enzim molekuláris formáinak szétválasztása

A mosott vvt membránokat és trombocitákat 0.5% Triton-X-100-t és 0.4 M NaCl-ot tartalmazó, 12.5 mM-os nátrium-foszfát pufferben (pH 7.2) homogenizáltuk, és az enzim molekuláris formáit 5-20%-os szukróz grádiensen, ultracentrifugálással különítettük el (Rakonczay és mtsai 1981). A plazma mintákat közvetlenül rétegeztünk a grádiensre. Az ultracentrifugálás SW-65 rotorral, 60 000 rpm-en történt 8 órán keresztül 4 °C-on.

Szedimentációs markerként borjú szérum albumint, β-galatozidáz és kataláz enzimeket és FITC jelölt IgG-t használtunk.

10.1.10.4. A vérplazma és az agyi membrán preparátumok malondialdehid tartalmának mérése

A humán vérplazma, valamint a koleszterin diétán tartott nyulak vérplazmájának és agyi membrán preparátumainak tiobarbiturátsav reaktív anyagait, malondialdehid szintjeit a -80 °C-ra fagyasztott mintákból tiobarbiturátsavas meghatározással Placer és mtsai (1966), valamint Buege és Aust (1978) módszere szerint végeztük. Az egyes minták tiobarbiturátsav reaktív anyag szintjeit kalibrációs görbe malondialdehid ekvivalens értékeihez hasonlítottuk, melyet 1,1,3,3-tetraetoxipropán-savas hidrolízise révén határoztunk meg.

10.1.10.5. ApoD kimutatása Western immunoblottal

Az AK és KT személyek mediális temporális lebenyébıl származó agyminta darabokat -80 °C-on tároltuk. A kortikális szürkeállományt mechanikusan választottuk szét, megtisztítottuk az erektıl, agyhártya daraboktól és a fehérállománytól. A kortex darabokat 10 másodperces szonikálásssal szolubilizáltuk 1%-os SDS-ben, amelyet PBS-ben oldottunk fel, majd a mintákat vízfürdıben forraltuk 5 percig.

Az immunoblot kísérletben 10 µg fehérjét vittünk fel 12%-os SDS-poliakrilamid gélre, emlı ciszta folyadékból tisztított apoD-t használva belsı standardként. Az elektroforetikusan szétválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra transzferáltuk. 5%-os zsírtalanított tejben történı blokkolás után biotin-jelölt humán apoD ellenanyaggal inkubáltuk a membránt

_____________________________________________________________________________________________

(McConathy és Alaupovic 1986) 1000x hígításban szobahımérsékleten 1 óráig. Ismételt mosásokat követıen sztreptavidin alkalikus foszfatáz-konjugált másodlagos ellenanyaggal 2000x hígításban inkubáltuk a membránokat további 1 óráig. Az elsıdleges és másodlagos ellenanyagokat TRIS-pufferelt NaCl oldatban inkubáltuk a membránnal, amely a mosások esetében 0.05% Tween 20-at is tartalmazott. A fehérjéket BCIP/NBT foszfatáz szubsztrát kittel jelöltük (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithhersburg, MD, USA). A blottokat lézer denzitométerrel értékeltük. Az egyes csíkok festıdését önkényes relatív egységekben adtuk meg.

10.1.10.6. Az ApoD immunhisztokémia humán agymintákból

Az 5 mm vastag agyszövet darabokat 4%-os paraformaldehid-foszfát puffer oldatban fixáltuk két napig. A paraffinba ágyazás után 7 µm vastag metszeteket készítettünk a mintákból, amelyeket polilizin kezelt tárgylemezekre szárítottunk. Deparaffinizálás után 1% kecskesavóval blokkoltuk a nem specifikus kötıhelyeket szobahımérsékleten, 1 órán keresztül. Ezt követıen humán apoD ellenes poliklonális kecske antiszérum (1:200) inkubálás következett, 1 órán keresztül, szobahımérsékleten, nedveskamrában. Háromszori mosás után, polivalens sztreptavidin alkalikus foszfatáz-konjugált másodlagos ellenanyag jelölés következett, 200x hígításban, 1 órán keresztül, PBS oldatban. A színreakciót Liquid Fast Red Chromogen Kit (Cell Marque, Austin TX, USA) segítségével hoztuk létre. Az immunhisztokémiai festést követıen a metszeteket hematoxilin-eozin festékkel is festettük. Az agyminták immunhisztokémiai festésével párhuzamosan humán emlıszövetet és véralvadékot is festettünk apoD-re pozitív kontrollként hasonló módszerekkel. Az agyminták esetében, párhuzamos mintákból immunhisztokémiai festések történtek egér monoklonális GFAP ellenanyaggal 100x-os hígításban (Cell Marque, Austin TX, USA). A Bielschowsky-festést pedig a SzP-ok és a NFF-ok közös jelölésére alkalmaztuk.

10.1.10.7. A vérplazma és a vvt-k KAT aktivitásnak meghatározása

A KAT méréseket Mason (1954) módszerének módosításával végeztük (Hartai és mtsai 2005). Az eredményeket hemoglobin tartalomra vagy teljes plazma fehérjére számítva, a vvt-k esetében pmol/mg Hb/óra, a vérplazma esetében pedig pmol/mg fehérje/óra értékekben fejeztük ki.

10.1.10.8. A vérplazma és a vvt-k KIN és KINA tartalmának meghatározása

A vérplazma és a vvt-k KIN és KINA szintjeit Wu és mtsai (2000) módszere szerint mértük. Röviden összefoglalva, a mosott vvt-ket desztillált vízzel (1:1 arányban) összekeverve hemolizáltuk, majd 3500 fordulat/perc sebességgel 15 percig centifugáltuk 24 ^oC-on. 800 µl üledékekhez 3.2 ml acetonitrilt adtunk a fehérjék kicsapása céljából. A csapadékot 3500 fordulat/perc sebességgel 10 perces centrifugálással ülepítettük. A felülúszót 50 ^oC-os

termosztátba helyezve nitrogén gázáram alatt koncentráltuk. Ezt követıen víz/acetonnitril (1:1) arányú keverékében oldottuk fel a mintákat, és a korábbihoz hasonló módon, nitrogén alatt teljesen bekoncentráltuk. A mintákat 150 µl desztillált vízben oldottuk fel a mérések elıtt és 12000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk 24 ^oC-on. Ezt követıen a felülúszót 8%-os perklórsavval 1:1 arányban keverve a maradék fehérjét is kicsaptuk, majd az elızıekben leírt centrifugálást ismételtük meg a precipitátum eltávolítása céljából. A minták KIN és KINA tartalmát Agilent 1100 HPLC készülékkel mértük. A KIN esetében UV 365 nm hullámhosszt és 2.3 perces retenciós mérési idıt, a KINA esetében pedig 344 nm-es excitációs és 398 nm-es emissziós idıt alkalmaztunk, 6 perces retenciós idıvel. 100 µl-t töltöttünk a mintákból Hypersil 5 ODS HPLC (150 x 4 mm-es) Thermo-Separation oszlopra, melyet 1 ml/perc áramlási sebességgel mostunk 0.2 M-os zink acetát és 5%-os acetonitril (pH 6.2) oldatával. Az eredményeket a KIN esetében µM-ban a KINA esetében pedig nM-ban adtuk meg.