Milyen az AK betegek trombocitáinak membrán fluiditása és plazma MDA szintje?

Zubenko és mtsai 1987-ben számoltak be arról, hogy az AK betegek trombocita membránjai fiziko-kémiai tulajdonságaikban, membrán fluiditásukban eltérnek a KT személyektıl. Ezt a megfigyelést más munkacsoportok is megerısítették (Hicks és mtsai 1987;

Piletz és mtsai 1991; van Rensburg és mtsai 1992), továbbá az AK betegek hippokampális membrán preparátumaiban is hasonló eltéréseket, fokozott membrán fluiditást találtak (Zubenko és mtsai 1986). A trombocita membránok fokozott membrán fluiditását a korai kezdető familiáris formák esetében találták kifejezettebbnek (Zubenko és mtsai 1987), lehetséges autoszóm öröklésmenettel (Chakravarti és mtsai 1989), és az eltérés a korai demencia kezdet jó prediktorának bizonyult (Zubenko és mtsai 1988). Más szerzık azonban nem tudták megerısíteni az eredményeket (Kukull és mtsai 1992). Az AK amiloid hipotézise szempontjából az is fontos szempont, hogy a BAP és származékai interakcióba lépve a membránokkal, önmagukban is képesek a fluidiást módosítani, rigidizációt okozhatnak (Eckert és mtsai 2005).

Vizsgálatainkban az említett szerzık megfigyeléseibıl kiindulva léptünk tovább, és háromféle membrán jelölıt párhuzamosan alkalmazva térképeztük fel az AK-os betegek trombocita membránjainak különbözı töltéső régióit (Kálmán és mtsai 1994). A DPH a membránok hidrofób magjában helyezkedik el, a TMA-DPH a negatívan töltött membrán doméneket, régiókat (a membránok belsı oldala) jelöli, a DPH-PA pedig a pozitív töltéső sejtfelszíni domének fluiditás változásairól ad infomációt.

Az AK trombociták membrán fluiditását vizsgálva, több kérdésre szerettünk volna választ kapni: 1. Reprodukálhatóak-e a Zubenko munkacsoport eredményei magyar sporadikus AK-os betegeket vizsgálva? 2. Van-e különbség a sporadikus és pozitív familiáris demencia anamnéziső betegek trombocitáinak membrán fluiditásában? 3. Az AK trombocita membránok egyes, különbözı töltéső doménjei különböznek-e fluiditásuk tekintetében? 4. A trombocita membránok fluiditásának esetleges eltérései kapcsolatba hozhatók-e olyan lipid peroxidációs paraméterrel, mint a plazma MDA szintje?

DPH fluoreszcens próbát alkalmazva, eredményeink megerısítik a korábbi vizsgálatok adatait, azaz mind a pozítív-, mind a negatív családi anamnéziső AK-os betegek trombocita

membránjai fluidabbaknak bizonyultak a membránok középsı rétegében, mint a KT személyeké. A DPH-val mért membrán fluiditás alapján azonban nem lehetett a két AK alcsoportot elkülöníteni egymástól.

Az AK és KT trombocita membránok fluiditási eredményeit a 9. táblázat foglalja össze.

9. táblázat Kontroll és Alzheimer-kóros betegek trombocita membrán preparátumainak fluoreszcens anizotrópia értékei.

Alzheimer-kór a családi anamnézisben Fluorescens festék Kontroll

(n=26)

Negatív családi demencia anamnézis

Pozitív családi demencia anamnézis

DPH 0.265±0.020 0.226±0.021* 0.238±0.016*

TMA-DPH 0.288±0.024 0.292±0.026 0.295±0.019

DPH-PA 0.295±0.030 0.286±0.028 0.326±0.031*

*p<0,05

A membránok belsı, negatívan töltött doménjeit jelölı TMA-DPH-t alkalmazva nem találtunk különbségeket az egyes csoportok között. A külsı, pozitívan töltött rétegek membrán fluiditása azonban szignifikánsan csökkent volt, de csak a pozitív családi demencia anamnézissel rendelkezı AK-os betegek esetében.

Mivel a membránok fluiditásának csökkenését komponenseik peroxidációja is okozhatja (Dobretsov és mtsai 1977), méréseink második szakaszában a vizsgálati személyek plazma MDA szintjeit határoztuk meg. (10. táblázat).

10. táblázat Plazma malondialdehid (MDA) szintek a kontroll és Alzheimer-kóros betegek vérében.

Alzheimer-kór Kontroll

(n=26)

Negatív családi demencia anamnézis

(n=15)

Pozitív családi demencia anamnézis

(n=11)

MDA (nM/ml) 11.59±2.45 10.98±3.26 12.29±1.92

Az MDA szintek tekintetében nem találtunk szignifikáns különbségeket egyik vizsgálati csoportban sem. Eredményeink arra utalnak, hogy az AK trombociták membránjának fluiditás eltérései valószínőleg közvetlenül a membrán komponensek fiziko-kémiai tulajdonságainak változásaira, nem pedig a plazma általunk vizsgált változóival vannak összefüggésben.

Bár az itt bemutatott trombocita membrán fluiditás méréseink óta 13 év telt el, az ide vonatkozó eredményeink az utóbbi évek AK koleszterin hipotézisével kapcsolatos megfigyeléseinek tükrében új jelentıséget nyertek. Az azóta felhalmozódott ismereteink alapján a membránok fluiditás eltérései akár a KIR-ben, akár a trombociták esetében, egyre több, az APP sejtmembránokhoz kötött metabolizmusával és az AK amiloid hipotézisével összefüggı közvetlen és közvetett kapcsolatra utalnak (Kálmán és Janka 2005a). A trombocitákat több

_______________________________________________________________________________________________________

szempontból is az AK perifériás modell rendszerének tekintjük: alfa granulumaikban nagy mennyiségben tárolják, és aktivációjuk során fel is szabadítják az APP-t (Van Nostrand és mtsai 1990; Skovronsky és mtsai 2001). A különbözı APP izoformák kimutathatóak a trombocita membránokban normál személyek és AK-os betegek esetében is, és arányaik változása AK specifikusnak bizonyult (Di Luca és mtsai 1998). Ezen kívül, a trombociták az APP poszt-transzlációs processzingjéhez szükséges enzimekkel, specifikus szekretázokkal is rendelkeznek (Colciaghi és mtsai 2004). Jans és mtsai (2006) pedig bebizonyították, hogy az ateromában lerakódó trombociták APP-t szabadítanak fel, melybıl BAP is keletkezik, és a többi mediátorral együtt ezek az amiloidogén peptidek is részt vesznek a makrofágok mőködésének szabályozásában, és az ateroszklerotikus plakkok kialakításában. A trombociták tehát egyrészt az AK modell rendszerének is tekinthetık, másrészt a VD és AK közös patomechanizmusának szereplıi is.

Továbbá, a membrán komponensek közül a koleszterinrıl is ismert, hogy szerepet játszik a sejtmembránok fluiditásának regulációjában, befolyásolva az ide lokalizálódó szignalizációs és transzport folyamatokat (Simons és Ikonen 1997; Puri és mtsai 1999; Sing és mtsai 1999; Suzuki 2002). Ha a sejtmembrán koleszterin tartalma emelkedik, fokozódik rigiditása (ezt tapasztaltuk az AK trombociták membránjai esetében DPH-PA jelölıt alkalmazva a betegek egy alcsoportjánál), és csökkenhet permeabilitása a vízoldékony molekulák számára. A koleszterin részt vesz a sejtmembrán kompartmentumok, a raftok kialakításában is. A raftokban a szfingolipid molekulák szénhidrát láncai közé beékelıdı koleszterin molekulák tömörítik a membránt, rendezett folyadék fázisokat hozva létre befolyásolják annak polaritását és a szignalizációs folyamatokat, módosíthatják a membrán integráns fehérjék pl. az APP molekula és hasító enzimjei, az alfa béta és gamma szekretázok funkcionális állapotát, mőködését (Sankaram és Thompson 1990; Smart és mtsai 1999).

Ha a neuronális membránok folyékony mozaik modelljében gondolkodunk, nem csak a horizontális, hanem a vertikális kompartmentalizáció is, azaz a sejtmembránok rétegeinek koleszterin tartalma is meghatározó jelentıségő lehet a membránok mőködése szempontjából, és az életkorral is változik. Fiatalkorban mind az exo-, mind az endoplazmatikus membrán réteg koleszterin tartalma alacsony az öregedés során a koleszterin egyre jobban az exoplazmatikus oldalon halmozódik fel, annak rigiditását fokozva (ezt találtuk a pozitív családi anamnéziső AK betegeink trombocitái esetében). Ha az AK amiloid hipotézisét vesszük alapul, könnyen beláthatjuk, hogy ez a folyamat a korábban említett szempontok alapján a BAP felhalmozódást segíti elı.

A kísérleteinkben megfigyelt eltérések, azaz a sejtmembránok fluiditásának változása az APP molekula poszt-transzlációs processzingjében résztvevı enzimek mőködését is

befolyásolhatja. A magas koleszterin szint és következménye a rigidebb sejtmembrán gátolhatja az alfa szekretáz mőködését (Simons és mtsai 1998; Frears és mtsai 1999, Fassbender és mtsai 2001). Másrészt a sejtmembránok fluiditásának fokozódása a koleszterin tartalmuk csökkenése révén gátolhatja az APP endocitózisát is, és így az nagyobb eséllyel bontódhat le a sejtmembrán alfa szekretázai révén (Racchi és mtsai 1997).

Összefoglalva, a trombocita membránok középsı rétegének fluiditás fokozódását mutattuk ki pozitív és negatív demencia családi anamnéziső magyar AK-os betegek esetében (Kálmán és mtsai 1994), megerısítve a korábbi adatokat. Elsıként bizonyítottuk, hogy a pozitív demencia családi anamnéziső AK-os betegek trombocita membránjainak külsı rétege csökkent fluiditású. A vérplazma MDA szintjei (lipid peroxidációs metabolit) nem mutattak összefüggést a membránok fizikai tulajdonságainak változásával. Eredményeink magyarázhatják az AK-os betegek trombociáinak APP metabolizmus eltéréseit.

3.6. Kimutatható-e az apoD az AK-os betegek agyában, és ha igen, jelenléte kapcsolatba