Bioelőkészítés szilárd fázisú fermentációval előállított hidrolitikus és oxidatív

A kétezres évek elején nyilvánvalóvá vált, hogy a bioelőkészítés sikeres és széleskörű elterjedését elsősorban a pamutmaghéjak nem megfelelő mértékű eltávolítása gátolja⁴⁴. A nyers szövet felületén apró barna foltokként megjelenő maghéjak (29.a ábra) lignin-holocellulóz rendszere a bioelőkészítés során csak részlegesen degradálható. A maghéj lignin komponensének a degradációját ugyanis oxidatív enzimek katalizálják.

Kutatómunkánkban szilárd fázisú fermentációval oxidatív enzimeket állítottunk elő. A szilárd szubsztrátum (szénforrás) kémiai összetétele, részecskemérete, vízvisszatartása és fajlagos felülete alapvetően befolyásolja a fermentáció eredményességét és a hozamot.

Lignocellulóz szubsztrátok alkalmazása például pozitív hatással van a lignin-peroxidázok termelésére^176-179,77. Mivel elsődleges célunk a maghéj hatékony enzimes degradációja volt, ezért ebben a kísérletben pamutmaghéj hulladék volt a szilárd szubsztrátum, hogy elősegít-sük a szubsztrátspecifikus enzimkomplex indukálódását, és ezáltal a szöveten lévő maghéj szennyezés degradációjában eredményes enzimek előállítását. A szilárd fázisú fermentáció-val tehát célirányosan, pamutmaghéj szubsztrátumon állítottunk elő oxidatív és hidrolitikus

aktivitással rendelkező enzimkomplexeket, és vizsgáltuk hatékonyságukat a pamutmaghéj degradációjában, továbbá a lignin-tartalmú len bioelőkészítésében.

A fermentációhoz különböző törzsgyűjteményekből származó Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus és Trichoderma törzseket használtunk (4.2. fejezet). A fermentált maghéj szubsztrátumokból (29.b ábra) pufferes extrakcióval nyert nyers enzimoldatokat az enzimaktivitás vizsgálatokhoz, valamint a pamut és len bioelőkészítésében használtuk. Egy másik kísérlet-sorozatban az enzimben gazdag szilárd fermentummal végeztük a bioelőkészítést.

29. ábra. (a) Maghéjak a pamutszöveten; (b) Ph. chrysosporium NCAIM F00740 törzs

szi-lárd fázisú fermentációja pamutmaghéj szubsztrátumon (SEM, 5000)^229,231 A szilárd fermentumok színe és szemcsemérete, valamint a gombaszaporodás mér-téke eltérő volt a különböző gombatörzseknél. Legjelentősebb enzimtermelést az Aspergillus oryzae és a Phanerochaete törzsek mutattak. Valamennyi gombatörzs termelt cellulolitikus enzimeket és xilanázt, valamint lakkáz, lignin peroxidáz és mangán peroxidáz aktivitást is mértünk a nyers enzimoldatokban (10. táblázat).

A nyers enzimoldatokat először a szövettől elkülönített maghéjvizsgálatok során tesz-teltük. A legeredményesebb Phanerochaete chrysosporium (NCAIM F-00740) és Aspergillus oryzae (NRRL 3485) törzsek 28-29 %-os tömegveszteséget okoztak, és a Phanerochaete chrysosporium esetén a kezelőoldatban jelentős volt a redukáló cukor koncentráció. Össze-hasonlításképpen megvizsgáltuk az ipari Celluclast 1.5 L celluláz (1 g/l, f=1:100, 50 °C, 1 óra), valamint a Roglyr Lite 1540 lakkáz (az SSF-fel termelt nyers enzimoldatok lakkáz aktivitásával megegyező koncentrációban alkalmazva) enzimmel elérhető maghéjdegradációt. A cellulázzal 23 %-os tömegcsökkenést mértünk, a lakkáz pedig nem degradálta a pamutmag-héjat [nem publikált eredmények]. Az előkísérletek tehát az SSF-fel előállított, hidrolitikus és oxidatív aktivitással jellemezhető enzimkomplexek eredményességét bizonyították.

a b

10. táblázat. A szilárd fázisú fermentációval termelt enzimek legjelentősebb aktivitás értékei egységnyi tömegű fermentált pamutmaghéj szubsztrátumra vonatkoztatva²²⁹

Törzs és az azt követően alkalmazott képanalízis segítségével határoztuk meg. A kiindulási írtelení-tett pamutszövet maghéjasságához (100 %) viszonyítva, az enzimes kezelés után a szöveten maradó maghéjak száma is és területe is csökkent (30.a,b ábra). A Ph. chrysosporium NCAIM F00740 törzzsel értük el a legkedvezőbb hatást. Ígéretesnek bizonyult még a két Aspergillus törzs is. A nyers enzimoldatokkal a szöveten lévő maghéjak területe és száma a kiindulási érték közel 60 %-ára csökkent. A hagyományos lúgos főzéssel is hasonló mértékű csökkenés érhető el a szövet maghéjtartalmában³¹.^*

30. ábra. A szilárd fázisú fermentációban nyert nyers enzimoldatok maghéjdegradációra kifejtett hatása a különböző törzsek esetén. (a) A szöveten lévő maghéjak számának és (b)

területe a kiindulási értékhez viszonyítva²²⁹

*A fenti eredményeinkről Ian R. Hardin (Georgia Power Professor of Textile Science, GA, USA) az ”Enzymatic treatments versus conventional chemical processing of cotton” (Advances in textile biotechnology, Woodhead Publishing Limited.

Oxford, Chapter 6, p 132-149, 2010) című könyvfejezetben a következőket írja:

”A unique approach was the application of a hydrolytic and oxidative enzyme mixture produced by solid-state fermenta-tion on seed coat fragments (Csiszar et al., 2007). The seed coat fragments were used as a carbon source for the produc-tion of the enzymes, which were then applied to the seed coat fragments in fabrics, with promising results. At present, despite the advances that have been made, a completely enzymatic process for removing and decolorizing seed coat frag-ments in woven fabric has not been achieved, though the solid state fermentation approach seems to generate the specific enzymes that will be needed for success.”

a b

Eredményesebb a maghéjdegradáció, ha a kezelést a fermentált szilárd szubsztráttal végezzük. Azonos enzimkoncentráció esetén a kiemelkedően eredményes Ph. chrysospo-rium NCAIM F00740 törzzsel például a maghéjak által elfoglalt terület 52 %-ra csökken, és hasonló eredmény érhető el az Aspergillus oryzae (NRRL 3485) és Aspergillus giganteus (NRRL 10) törzsekkel is (53-55 %). A Trichoderma virens (TUB F-498) törzzsel nyert nyers en-zimoldattal csupán 82 %-ra, a fermentált szubsztráttal viszont 55 %-ra csökkent a szövetfelü-leten visszamaradó maghéjak területe (nem publikált eredmények). Az eukaliptusz facelluló-zon SSF-fel előállított xilanázokról is bifacelluló-zonyították, hogy a fermentumok – elválasztás és tisz-títás nélkül – eredményesen alkalmazhatók az eukaliptusz cellulóz biofehérítésére¹⁸⁰.

Megjegyzendő, hogy a szövet maghéj-tartalmának kvantitatív jellemzésére eddig nem volt módszer a szakirodalomban. Az általunk alkalmazott és a képanalízisre alapozott megoldás alapjául szolgált azoknak a kutatásoknak, amelyek célja a szöveten lévő maghéjak gyors és megbízható detektálására alkalmas szoftverek fejlesztése és szabványosítása^181-183.

A len rost szerkezetének, valamint a lényegesen nagyobb természetes kísérőanyag tartalmának köszönhetően a szilárd fázisú fermentációval előállított enzimek hatása a lenszövetre jelentősebb, mint a pamutszövetre. Mindkét szövetnél a legnagyobb tömeg-veszteséget és redukáló cukor felszabadulást a Phanerochaete törzsek okoztak, amelyeknek jelentős a hidrolitikus (FPA, Xyl) aktivitása is. De míg a pamutszövetnél 2,2-2,7 %-os a tö-megveszteség, addig a len esetén 6-12 %-os (31.a ábra). Az enzimes kezelés során keletkező redukáló cukor koncentráció 7-9 mg/g szövet volt a pamutszövetnél, a lennél lényegesen nagyobb. A kezelés sokkal hatékonyabb a fermentált szubsztrátummal, mint a nyers enzim-oldattal (31.b ábra).

31. ábra. A szilárd fermentumok és a nyers enzimoldatok hatása (a) a nyers lenszövet tö-megveszteségére; és (b) az enzimes kezelés során keletkező redukáló cukor koncentrációra

az SSF-ben alkalmazott törzsek esetén²³⁰

a b

Az oxidatív és hidrolitikus enzimek szinergizmusa a len lignin-tartalmú színes kompo-nenseinek az eltávolítását eredményezi (32. ábra), ami szemmel észrevehető színváltozással jár (ΔE > 0,5). A biofehérítést, azaz a telítettség csökkenését és a világosság növekedését, színméréssel igazoltuk. A fermentált szubsztrátummal jelentősebb a világosodás (ΔL pozitív) és az elszíntelenedés (ΔC negatív), mint az enzimoldattal. Leghatékonyabbnak a Ph.

chrysosporium VKM F-1767 törzs bizonyult (Eab*

=4,8; ΔL^*=4,3; Cab*

=-2,2).

32. ábra. (a) A nyers enzimoldatoknak, valamint (b) a szilárd fermentumoknak a nyers lenszövet színére kifejtett hatása az SSF-ben alkalmazott különböző törzsek esetén²³⁰

Színkülönbség értékek a nyers lenszövet színéhez viszonyítva.

Az enzimes kezelés után alkalmazott enyhe hidrogén-peroxidos fehérítés (30 %-os H2O2,1 ml/l) során bebizonyosodott, hogy az enzimezett lenszövet fehéríthetősége lényege-sen felülmúlja a nem enzimezett kontroll mintáét (11. táblázat). Míg a kontroll minta fehér-ség növekedése 13,3, addig a Ph. chrysosporium VKM F-1767 enzimoldattal kezelt szöveté 17,3. A szövetek végső fehérsége között is jelentős a különbség (13,8 és 18,5). Legnagyobb fehérségi mérőszámot a Ph. chrysosporium VKM F-176 fermentummal előkezelt és fehérí-tett szövet estén mértünk (20,2). Az enzimes kezelés tehát hatékonyabbá teszi az azt követő vegyszeres kezelést, azaz a fehérítést. Hasonló hatást tapasztaltunk korábban a hidrolitikus enzimekkel végzett maghéjdegradációt követő lúgos főzés után¹⁷⁰, és mások is azt találták, hogy a bioelőkészítés fokozza az azt követő vegyszeres kezelés eredményességét¹⁸⁴.

Összefoglalva tehát: szilárd fázisú fermentációval célirányosan, pamutmaghéj hulla-dékon, mint szénforráson állítottunk elő hidrolitikus és oxidatív aktivitással rendelkező enzimkomplexeket, majd alkalmaztuk azokat a pamutszöveten lévő maghéjak degradációjá-ra. Az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy az enzimkomplexek alkalmasak a pa-mutmaghéj hatékony degradációjára. A nyers fermentum közvetlenül is alkalmazható, és eredményessége felülmúlja a nyers enzimoldatét. Más kutatók szerint is különböző aktivitá-sú (celluláz, pektináz, xilanáz, lignin-oxidáz) enzimekkel érhető el jelentős

maghéj-a b

degradáció⁴¹. A nyers enzimek és a szilárd fermentumok bontják a len lignin-tartalmú színes kísérőanyagait is. Különösen a szilárd fermentummal végzett kezelés a hatékony, és a szövet jelentős világosodását eredményezi. A lenszövet fehéríthetősége jobb, mint a nem enzime-zett kontroll mintáé.

11. táblázat. A nyers enzimoldattal, valamint a szilárd fermentummal kezelt lenszövet hidro-gén-peroxidos fehérítése. Fehérségnövekedés és az elért végső fehérség az SSF-ben

alkalma-zott különböző törzsek esetén^{a, 230}

b Fehérség növekedés: az enzimezett szövet fehérségéhez viszonyítva;

c Fehérség: WIE313.