Az EDTA komplexképző hatása a bioelőkészítésben 223,226,227

[T2]

A pektin molekulára jellemző ún. ’tojásosdoboz’ szerkezet (5. ábra) a galakturonsav egységek szabad karboxil-csoportjai és a kalcium-ionok reakciója eredményeként jön létre. A pamutban, és különösen a pamutmaghéjban, jelentős a kalcium-ionok mennyisége. (A mag-héj kalcium-ion tartalma kb. 28-szorosa a pamutszálénak³⁶.) A kalcium eltávolításával (pl.

komplexképzéssel) az egymás mellett futó pektin molekulák között a keresztkötések eltűn-nek, megszűnik az eredeti szabályos szerkezet, ami befolyásolhatja a pektin enzimes degra-dációját és ennek révén a bioelőkészítés eredményességét. Ugyanakkor a komplexképző az enzimre is hat^76,93, mivel a kalcium és más kétértékű fémionok eltávolítása károsíthatja az enzim tercier szerkezetét, ami enzimaktivitás csökkenést okozhat. Mivel a len enzimes feltá-rása során az EDTA komplexképző alkalmazásával érték el a legjobb eredményeket^15-16, ezért a bioelőkészítésben mi is az EDTA hatását vizsgáltuk részletesen.

A kutatómunkában indokoltnak tartottuk megvizsgálni (1) az enzimaktivitás alakulá-sát EDTA komplexképző jelenlétében; (2) az EDTA komplexképző pamut- és lenszövetre, valamint pamutmaghéjra gyakorolt hatását; továbbá (3) a pamut és len bioelőkészítését EDTA jelenlétében. A kutatómunkában tehát az EDTA, EDTA-szubsztrátum és enzim-EDTA-szubsztrátum kölcsönhatás jellemzésére koncentráltunk. Az EDTA enzimaktivitásra kifejtett hatásának a tisztázásához a poli-galakturonázban gazdag Viscozyme 120L és a csak xilanáz aktivitással rendelkező Pulpzyme HC enzimeket használtuk. Mindkét enzim tartalmaz komplexálható fémionokat (8. táblázat). A kalcium-ionok mennyisége a Pulpzyme HC en-zimben lényegesen nagyobb, mint a Viscozyme 120L enen-zimben.

8. táblázat. A pektináz (Viscozyme120L) és xilanáz (Pulpzyme HC) enzim fémion-tartalma ICP-OES módszerrel meghatározva²²⁷

Enzim Koncentráció (ppm)

Al Ca Fe K Mg Na P S

Viscozyme 120L 2,3 13,2 11,6 2860 101 39600 1160 721

Pulpzyme HC 18,5 2290 7,6 56 114 344 1250 427

Az enzimekhez EDTA komplexképzőt adtunk, és mértük az enzimek jellemző aktivitás értékekeit az EDTA-koncentráció függvényében. Az eredmények azt bizonyítják, hogy az EDTA nem befolyásolja az enzimek pektináz, illetve xilanáz aktivitását (25. a és b ábra).

Meg-jegyzendő, hogy a Viscozyme 120L enzim celluláz és xilanáz aktivitásában sem mértünk vál-tozást az EDTA jelenlétében. Feltételezhető, hogy a fémion nem a fehérje molekulába be-épülve, vagy nem az enzim működéséért felelős fehérje molekula részeként van jelen, így a komplexálás nem okoz szerkezeti változást és aktivitás csökkenést.

25. ábra. (a) A Viscozyme 120 L enzim pektináz aktivitása és a (b) Pulpzyme HC enzim xilanáz aktivitása az EDTA koncentráció függvényében²²⁷

Az EDTA komplexképző hatását a bioelőkészítésben a lenszövet példáján mutatjuk be, mivel a len pektin tartalma lényegesen nagyobb a pamuténál. A pektináz enzimmel (Viscozyme L) és EDTA komplexképzővel (1 mM/g szövet) a következő kísérleteket végeztük el: (a) pektináz enzimes kezelés; (b) pektináz enzim és EDTA együttes alkalmazása; (c) EDTA előkezelés, majd azt követően alkalmazott pektináz enzimes kezelés. Mértük a szövetben visszamaradó kalcium-ion koncentrációt ICP-OES módszerrel, továbbá követtük az enzimes hidrolízis során a termék koncentráció alakulását.

A nyers lenszövet kalcium-tartalma (2070 ppm) jelentősen csökken a kezelések során (26.a ábra). Különösen az EDTA és pektináz együttes alkalmazásakor eredményes a komplexálás, hiszen a kiindulási érték 80 %-kal csökken és a visszamaradó mennyiség csupán 416 ppm. Az EDTA-előkezelés után alkalmazott pektináz enzimes kezelés (EDTA + Pektináz) kevésbé hatékony (kb. 67 %-os csökkenés). A fémionokat a savas pufferes kezelés (kontroll) is eredményesen távolítja el, EDTA-val együtt és azt követően is. Az enzim és EDTA együttes alkalmazásakor bekövetkező jelentős fémion-tartalom csökkenést nagymértékű redukáló cukor felszabadulás kíséri, ami fokozódó hidrolízist jelez (26.b ábra). Feltételezzük, hogy a pektinben található kalcium-keresztkötések megszűnésével kialakuló nyitott szerkezet hoz-záférhetővé teszi a pektint az enzim számára, ahol az azonnal ki tudja fejteni a katalitikus hatását. Az EDTA tehát jelentősen befolyásolja a pektináz enzimes hidrolízis eredményessé-gét, mivel módosítja a pektin szerkezetét, és feltételezhetően javítja az enzim

hozzáférhető-a b

ségét a pektin szubsztrátumhoz. A csak pektinázzal végzett kezelés során felszabaduló redu-káló cukor koncentráció EDTA jelenlétében 13 %-kal nő. Az enzim és az EDTA szinergizmusa révén a hidrolízis is és a fémion-extrakció is az enzim-EDTA-szubsztrátum rendszerben a leg-hatékonyabb.

Az EDTA-val végzett előkezelés hatékonynak bizonyult a kalcium-ionok eltávolítás-ban, de csökkentette a pektináz enzim hatékonyságát. A felszabaduló redukáló cukor kon-centráció 17 %-kal elmarad a csupán pektináz enzimet tartalmazó kezelőfürdőben mért ér-téktől. A mérési eredmények alapján az feltételezhető, hogy az EDTA hatására – a kalcium-ionok komplexálása révén – kialakuló nyitott és hozzáférhető szerkezet csak ideiglenesen jellemzi a szálasanyagot. A kezelést követően valószínűleg „bezárul”, „összeomlik”, és ezáltal egy kevésbé hozzáférhető új szerkezet alakul ki, amely már nem kedvez az azt követően al-kalmazott enzimes reakciónak. Az EDTA kedvező hatása az enzimes kezelést követő öblítés során is megnyilvánult¹⁹³. A kutikula maradványainak az eltávolítása ugyanis magas hőmér-sékleten (90 °C) és nagy nedvesítőszer koncentrációnál (0,5 g/l), továbbá komplexképző al-kalmazásakor volt a legeredményesebb.

26. ábra. Lenszövet pektináz (Viscozyme L, pH 5) enzimes bioelőkészítése során az EDTA komplexképző (1 mM/g szövet) hatása (a) a szövetben visszamaradó kalcium-ion

mennyisé-gére; (b) az enzimes kezelés során keletkező redukáló cukor koncentrációra²²⁶

Kontroll: pufferes kezelés (pH 5);

Megvizsgáltuk az EDTA hatását egy másik szubsztrátumon – a pamutmaghéjon – is, és annak a megerősítését vártuk, hogy a kalcium-ionok komplexbe vitelével a pamutmaghéj enzimes degradációja is fokozható. Pektináz és xilanáz enzimet alkalmaztunk a lenszövetnél ismertetett kombinációkban. Az EDTA-val együtt alkalmazott pektináz enzimes kezelés során

a b

a maghéjban visszamaradó kalcium-ionok mennyisége a legkisebb (27.a ábra), az enzimes folyamatban felszabaduló redukáló cukor koncentráció pedig a legnagyobb (27.b ábra). A kiindulási 34000 ppm-es kalcium-ion koncentráció EDTA és enzim együttes alkalmazásakor 11990 ppm-re csökken, míg a kétlépéses EDTA + pektináz enzimes kezelés után a mért érték 13200 ppm. A csak pektinázzal végzett kezeléshez képest az EDTA és enzim együttes alkal-mazásával 72 %-kal nő a felszabaduló redukáló cukor koncentráció. Az EDTA előkezelés pe-dig közel azonos mértékben (71 %) csökkenti azt. A 26. és 27. ábrán bemutatott eredmé-nyek tehát két különböző szubsztrátum esetén bizonyítják az EDTA kedvező hatását a pektináz enzimmel végzett bioelőkészítésben.

27. ábra. Pamutmaghéj pektináz (Viscozyme L, pH 5) enzimes bioelőkészítése során az EDTA (0,5 mM/g maghéj) hatása (a) a maghéjban visszamaradó kalcium-ion mennyiségére; (b) az

enzimes kezelés során felszabaduló redukáló cukor koncentrációra²²⁷

Xilanáz enzimmel és EDTA-val végzett pamutmaghéj degradáció során is hasonló ha-tás figyelhető meg (28. ábra). A lignocellulóz rendszerekben, mint amilyen a nyers len és a pamutmaghéj, a cellulóz fibrillákat a pektin és xilán polimerek által létrehozott mátrix veszi körül (5.b és 6.b ábra). A pektin és a xilán egymáshoz viszonyított helyzetét és az általuk lét-rehozott rendszert jól jellemezhetjük az egymásbahatoló háló (interpenetrating network) kifejezéssel. Egy ilyen rendszerben, az egyik polimerben lezajló változás a másik hozzáférhe-tőségét és reakcióképességét is megváltoztathatja. A kalcium-ionok kivonása a pektinből fokozza az ezzel egyidejűleg alkalmazott xilanáz enzimes hidrolízis hatékonyságát, amit a 38 %-kal nagyobb redukáló cukor koncentráció bizonyít (28.b ábra). Ugyanakkor, az EDTA-val végzett előkezelés nem kedvez a xilán enzimkatalizált hidrolízisének, ami a 22 %-os redu-káló cukor koncentráció csökkenésben nyilvánul meg.

a b

Az eredmények értékelésekor érdemes a két enzim hatását is összevetni. Mivel a pektináz enzim celluláz aktivitással is rendelkezik (5. táblázat), ezért a kalcium-ionok eltávo-lítása és ennek révén a pektin hatékony degradációja hozzájárul a cellulóz fibrillák hozzáfér-hetőségének a növeléséhez és hidrolízisük fokozódásához, ami lényegesen nagyobb felsza-baduló redukáló cukor koncentrációt eredményez, mint a csak xilanázzal végzett folyamat (lásd 27.b és 28.b ábra). A cellulóz-xilán-pektin hálózat cellulóz és pektin alkotóinak degra-dációjával fokozódik a kalcium-ionok eltávolítása is.

28. ábra. Pamutmaghéj xilanáz (Pulpzyme HC, pH 7) enzimmel végzett bioelőkészítése során az EDTA (0,5 mM/g maghéj) hatása (a) a maghéjban visszamaradó kalcium-ion

mennyiségé-re; (b) az enzimes kezelés során keletkező redukáló cukor koncentrációra²²⁷

Hasonló következtetés vonható le a nyers pamut komplexképzővel végzett bioelőkészítése során mért tömegveszteség értékekből is (9. táblázat). A pamut elemi szál primer fala szintén egymásbahatoló hálónak tekinthető. A kalcium-ionok kivonása a pektin-ből elősegíti a pektin és a xilán degradációját, de fokozza a celluláz enzimek hatását is azál-tal, hogy a pektin-xilán mátrixba ágyazott cellulóz fibrillák hozzáférhetősége fokozódik. Leg-nagyobb tömegveszteséget a Celluclast 1.5 L enzim (3 %), legkisebbet a Pulpzyme HC enzim (1,4 %) okozott.

A maghéjvizsgálatok, továbbá a len- és pamutszövettel végzett kísérletek eredmé-nyei az enzim és az EDTA komplexképző együttes alkalmazásának a kedvező hatását bizonyí-tották a bioelőkészítésben. Az elmúlt időszakban az EDTA és más komplexképzők hatását a cellulóz alapú szálasanyagok bioelőkészítésében széleskörűen vizsgálták, és sok publikáció-ban igazolták a megállapításainkat106,171,172,175

. Az Innotex cég (Csehország, Dvur Kralove) Texazym SC márkanevű pektináz enzimjét a cég által forgalmazott Tannex BCAN

komplex-a b

képzővel együtt alkalmazva ajánlja a pamut bioelőkészítésére. A bioelőkészítés üzemesítése során mi is az enzimoldathoz adtuk a komplexképzőt.

9. táblázat. A pamutszövet tömegvesztesége a különböző aktivitású enzimekkel végzett bioelőkészítés során, EDTA nélkül vagy EDTA-val²²³

Kezelés^a Alkalmazott enzim és a mért tömegveszteség (%)

Celluclast 1.5L^b Viscozyme 120L^b Pulpzyme HC^c

Enzim 1,7 ± 0,3 1,6 ± 0,1 0,9 ± 0,1

Enzim és EDTA 3,0 ± 0,2 1,8 ± 0,2 1,4 ± 0,2

a 50 °C, 1 óra, f=1:100, 0,5 mmol EDTA, 1 g/l enzim, rázatott;

b pH=5;

c pH=7.

Összefoglalva megállapítható, hogy a bioelőkészítés hatékonysága jelentősen növel-hető az enzimoldathoz adott komplexképzővel. Bizonyítottuk, hogy az EDTA komplexképző a vizsgált koncentráció tartományban nem csökkenti a hidrolitikus enzimek (pektináz és xilanáz) domináns aktivitását. Feltételezzük, hogy az EDTA módosítja a szubsztrát (lenszövet, pamutmaghéj) szerkezetét azáltal, hogy eltávolítja a pektin makromolekulák között kereszt-kötést létesítő kalcium-ionokat. Az enzim és EDTA szinergizmusa révén az enzim-EDTA-szubsztrát rendszerben az enzimkatalizált reakció is és a fémion-extrakció is hatékonyabb.

Az EDTA-val végzett előkezelés nem segíti az azt követően alkalmazott enzimes reakciókat.

5.1.5 Bioelőkészítés szilárd fázisú fermentációval előállított hidrolitikus és oxidatív