Az anyai örökség

3.1.8.1. A mitokondriális DNS szerkezete

A humán mitokondriális genom DNS szekvenciáját először 1981-ben írták le [38], és az első leírójának neve, illetve a laboratórium helyszíne után szokás Anderson vagy Cambridge referencia szekvenciaként (CRS) emlegetni. A humán mitokondriális genom egy kb. 16569 bp hosszú cirkuláris DNS-molekula, ami egy pirimidin bázisokban gazdag „könnyű” és egy túlnyomórészt purin bázisokból álló „nehéz” szálból áll (5. ábra). A molekula 15447 bp hosszú kódoló szakaszán 37 gén lokalizálódik, intronok nélkül összetömörítve. A 37 génből 22 gén transzfer RNS-t kódol (tRNS), 2 gén riboszómális RNS-t (12S és 16S rRNS), 13 gén pedig az oxidatív foszforilációban és ATP-szintézisben közreműködő enzimeket. A mitokondriumok normális működéséhez szükséges összes többi gén a sejtmagi DNS-ben lokalizálódik. Később, 1999-ben Andrews és munkatársai [39] újra elemezték a szekvenciát, amely azóta a rCRS (revised Cambridge Reference Sequence) néven lett ismert.

2012-ben Behar és munkatársai javasolták [40], hogy használják a RSRS (Reconstructed Sapiens Reference Sequence) jelölést a rCRS helyett, ahol a referencia szekvencia egy valaha élt afrikai nő mtDNS-e. A ma élő összes nő származtatható az említett afrikai ősanyától, azaz a „mitokondriális Évától”. Ennek ellenére az RSRF használatának indokolt volta még vitatott.

5. ábra. A humán mtDNS vázlatos szerkezete és a gének egyszerű lokalizációja⁵ Az ábrán látható D-loop régió (hipervariábilis régió) szekvenciájának a rCRS szekvenciától

való eltérése adja meg a haplotípust igazságügyi genetikai szempontból.

5 https://www.intechopen.com/books/molecular-considerations-and-evolving-surgical-management-issues-in-the-treatment-of-patients-with-a-brain-tumor/understanding-mitochondrial-dna-in-brain-tumorigenesis

A molekulában természetes variációként megfigyelhető egy-két bázist érintő inszerciós/deléciós mutációk miatt a molekula összes nukleotidának száma egyénenként, sőt sejtenként, molekulánként is (hossz-heteroplazmia) változhat. A mitokondriális DNS-molekulát a kódoló régión kívül egy kb. 1122 bázispár hosszúságú nem kódoló szakasz az ún.

hipervariábilis régió alkotja. A hipervariábilis régiót gyakran „D-loop” szakasznak is nevezik, utalva a DNS replikáció során elektronmikroszkóp alatt látható képére. Mivel a D-loop nem kódol génterméket, kisebb rajta a szelekciós nyomás, ezért az egyedek között megfigyelt nukleotid variabilitás és polimorfizmus lényegesen nagyobb fokú itt, mint a kódoló régióban. A standard referencia szekvencia sorszámozása önkényesen a hipervariábilis régió közepén kezdődik kettéválasztva azt egy 16024-16569 bázisok közötti és egy1-576 bázisok közötti szakaszra. Az igazságügyben általánosan vizsgált szekvenciák az ún.

hipervariábilis régiók is ezekre a szakaszokra esnek: a hipervariábilis 1. régió (HV1) a 16024-16365 szakaszra, a hipervariábilis 2. régió (HV2) a 73-340 bázistartományra terjed ki (5. ábra), bár ezek a határok nem szigorúan meghatározottak, függnek az alkalmazott vizsgálati módszertől és a vizsgáló laboratóriumtól. A mitokondriális DNS variánsok (haplotípusok) megállapítása és leírása a revised Cambridge referencia szekvencia (rCRS) könnyű szálához viszonyítva történik, így pl. a 16126 nukleotid pozícióban észlelt citozin bázist 16126C jelzéssel írjuk le (vagy T16126C). Magától értetődő, hogy a referencia szekvenciától eltérést nem mutató nukleotid bázisokat nem kell jelölni.

3.1.8.2. A mitokondriális DNS vizsgálat jelentősége az igazságügyi genetikában

Az elmúlt években a mitokondriális DNS (mtDNS) analízis igazságügyi célú alkalmazása és jelentősége rendkívüli mértékben megnőtt, mivel olyan előnyös tulajdonságokkal is rendelkezik, melyekkel a nukleáris (sejtmagi) DNS állomány nem bír. A mtDNS átlagosan több ezer példányban található meg egy-egy szomatikus sejtben [41], a mitokondriumok kettős membránnal körül vannak véve, ezért a benne lévő DNS degradáció hatásától védett, ami különösen fontos az igazságügyi genetikai gyakorlatban.

Magasabb kópiaszámának köszönhetően vizsgálati érzékenysége nagyságrendekkel nagyobb a nukleáris DNS-hez képest, és ennél fogva a nagymértékben degradálódott, bomlott állapotú biológiai mintákból (pl. csontmaradványok, szőrképletek) való azonosításra is alkalmas. Kizárólag anyai ágon öröklődik [42, 43, 44], nem rekombinálódik [42, 45], mely tulajdonságok jelentősen megnövelik a biológiai anyagmaradványok beazonosításához

referencia mintaadóként számításba vehető személyek számát, hiszen az összes élő anyai ágon rokon személy ugyanazzal a mitokondriális DNS haplotípussal rendelkezik az esetleges mutációs eseményeket nem számítva. Ez az oka annak is, hogy egy mitokondriális DNS haplotípus nem egyedi, ami – az az Y-STR haplotípusokhoz hasonlóan – az egyezési valószínűségek mértékét csökkenti. A sejtmagi DNS állományhoz képest a mitokondrium kevésbé hatékony DNS javító mechanizmussal rendelkezik, ami magasabb mutációs rátát eredményez. A mitokondriális DNS replikációját végző polimeráz enzim pontos leolvasásbeli (proof-reading) hiányossága miatt nő a lehetséges mutációk gyakorisága. A sejtmagi DNS-nél kb. tízszer nagyobb mutációs ráta eredményeképpen jöhetnek létre a különböző variációk az egyébként azonos anyai vonalakból [13]. Cirkuláris jellege miatt viszont a molekula kevésbé fogékony exonukleázok támadása iránt, ami segít megőrizni kompakt állapotát és ezzel együtt vizsgálhatóságát, azonosíthatóságát.

A mtDNS haplotípusok pontos meghatározása nemzetközileg egységesített nevezéktan segítségével történik. Az igazságügyi genetikai vizsgálatok során kapott DNS szekvenciák leírásának nevezéktanát, a vizsgálatok végzéséhez elengedhetetlen minőségirányítási követelményeket, a szekvencia eredmények interpretálásának szabályait az ISFG (International Society for Forensic Genetics) és az EDNAP (European DNA Profiling Group) ajánlásokban, útmutatókban összegezte [46].

Igazságügyi aspektusból a heteroplazmia jelensége az egyik leginkább problémás vonása a mitokondriális genomnak. Ugyanis a mitokondriális DNS állomány egyéneken belül is diverzifikálódhat, ugyanis az egyes DNS-molekulák a sejtekben egymástól függetlenül replikálódnak (nincsenek kitéve a mitózisnak és a meiózisnak), egymással nem rekombinálódnak, és az osztódásuk során a mutációs ráta lényegesen nagyobb, mint a nukleáris genoménál. Kettő (vagy több) mitokondriális DNS típus szubpopulációjának jelenlétét egy egyénen belül heteroplazmiának nevezzük. Ezek a szekvencia variánsok egymástól függetlenül

replikálódnak és szegregálódnak. Bizonyos esetben egy-egy bizonyíték erősségét is növelheti, mint például az első, igazságügyben dokumentált pontmutációs heteroplazmia esetén [47] II.

Miklós cár és családja földi maradványainak azonosítása során. A szubsztitúciós heteroplazmiákon kívül gyakran megfigyelhető a policitozin szálak (mind a HV1 mind a HV2 régióban) hossz-heteroplazmiája is [48].

Az igazságügyi genetikán kívül számos további tudományág tanulmányozza a mitokondriális DNS variációkat. Orvosi genetikával foglalkozó szakemberek számos betegség és kórkép okaként írták le a mtDNS valamilyen mutációját [49]. Evolúcióbiológusok

és filogenetikusok fajok közötti és fajokon belüli variációk vizsgálatával tárják fel a rokonsági viszonyokat. A széles nyilvánosság számára is izgalmas eredmények születtek pl. a neandervölgyi ember maradványainak vizsgálata során [50], Ötzi mtDNS genomjának feltárása [51] vagy a „mitokondriális Éva” meghatározása [42, 52, 53] során.

Az igazságügyi célú mtDNS vizsgálat a célnak megfelelő populációs adatbázisokat igényel, amelyekkel megbecsülhető a kérdéses DNS-profilok (haplotípusok) gyakorisága az adott populációban. Ha egy eset kapcsán a bizonyíték és a gyanúsított mtDNS-haplotípusa megegyezik, a megfelelő referencia adatbázis alapján kalkulált haplotípus gyakoriság konzervatív becslését adja azon valószínűségnek, hogy a bizonyítékból kimutatott haplotípus a gyanúsítottól, vagy a populáció egy vétlen személyétől származik. Az elmúlt évek populációgenetikai kutatásai jól meghatározott különbségeket tártak fel a különféle eredetű populációk mtDNS haplotípus megoszlásában és ez az oka annak, hogy adott bizonyíték esetén a konkrét ügy egyéb körülményei is befolyásolják az alkalmazandó referencia adatbázist. Walther Parson jóvoltából, aki az innsbrucki egyetem professzora, létezik egy mtDNS adatbázis (http://empop.online/), amelynek segítségével kereshető a vizsgált haplotípus gyakorisága és annak alapján számolható valószínűségi hányados a vizsgált személy tekintetében [54, 55].

3.1.8.3. Mitokondriális haplocsoport meghatározás

Az mtDNS haplocsoport vizsgálata és a vizsgált populációk haplocsoport-összetétele igazságügyi genetikai szempontból – akárcsak az Y kromoszómális haplocsoportok esetében – nem bír annyira meghatározó jelentőséggel, mivel az mtDNS haplocsoportok száma az mtDNS haplotípusok számánál jóval kisebb. Egy mitokondriális haplocsoportba sok, különböző mitokondriális haplotípus tartozik, ezért a haplocsoportok vizsgálata leginkább kizárás megállapítására alkalmas. Egyezés esetén megfelelően magas valószínűségi hányados sem származási, sem bűnügyekben nem szolgáltatható. A mtDNS haplocsoportok mind a hipervariábilis régióban, mind a kódoló régióban egy-egy meghatározott pozícióban található nukleotidok jelenlétének összességével definiálhatók. A mtDNS haplocsoportok meghatározása informatív eszközként szolgál populációs és evolúciós tanulmányok során.

Ezek fontos szerepet játszanak a humán migrációval foglalkozó tanulmányokban, lehetővé teszik az egyes populációk, illetve populáció-csoportok közötti lényeges különbségek hatékony feltárását [3], a populációk történetének, vándorlásának vizsgálatát.