3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
3.1. Növényanyag
3.1.2. A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatához felhasznált növények
A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatánál 36 fogékony és 12 rezisztens növényt használtunk. A növények magjait Hoffmanné Pathy Zsuzsannától (Somogy Megyei Mezőgazdasági Szakigazgatási Hivatal Növény- és Talajvédelmi Igazgatóság) kaptuk. A rezisztencia kimutatása növényházi körülmények között 10 cm átmérőjű műanyag tenyészedényekben, 3 ismétlésben történt. A kísérletben tenyészedényenként legalább 10 értékelhető növény volt, melyek ugyanarról az anyanövényről származtak. A kezelést az atrazin 2,0 kg/ha-os dózisával közvetlenül a vetés után, preemergensen végeztük. A rezisztensnek tűnő mintákat minden esetben ugyanezzel a dózissal posztemergens kezelésben is részesítettük. A növényeket
3.1 Acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidek célgénjének szekvenálásánál vizsgált növények
Az ALS-A fragmentum szekvenciáját hét véletlenszerűen begyűjtött parlagfűben és egy napraforgóban (Nova hibrid) határoztuk meg. A parlagfüvek közül négy származott Keszthelyről, kettő Hódmezővásárhelyről és egy Montreálból (Kanada).
Az ALS-B fragmentumot három keszthelyi, egy hódmezővásárhelyi parlagfűből és egy napraforgóból (Nova hibrid) szekvenáltuk.
3.1.4 Az Amb a I géncsalád vizsgálatánál tesztelt növények
Az Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 cDNS-ekre tervezett primerek: RW32, RW38, RW45 (Rafnar és mtsai 1991) tesztelését öt parlagfű DNS-én végeztük. Melyek közül három keszthelyi és kettő hódmezővásárhelyi gyűjtésből származott. Az általunk tervezett Amb a I specifikus primereket szintén ezen az öt egyeden teszteltük, majd a vizsgálatokat kiterjesztettük további hét növényre melyek magjai közül egyet Keszthelyen, kettőt Hődmezővásárhelyen és 2-2 Montreal és Madison közelében gyűjtöttünk.
3.2 Molekuláris vizsgálatok 3.2.1 DNS izolálás
A DNS-t minden növényből Walbot és Warren (1988) eljárását követve izoláltuk, de kisebb módosításokat hajtottunk végre.
Felhasznált anyagok:
- Lízis oldat: 15 % szacharóz
50 mM Tris HCl (pH 8.0) 50 mM EDTA (pH 8.0) 500 mM NaCl
- 20T – 10E puffer: 20 mM Tris HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) - TE puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1.5 mM EDTA (pH 8.0) - 7,5 M ammónium-acetát
- 20 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - Izopropanol
- CIA: kloroform/izoamil-alkohol: 24 : 1 arányban - 3 M nátrium-acetát
- 96 %-os és 70 %-os etanol
A növények fiatal leveleit (100 mg) folyékony nitrogén jelenlétében porrá zúztuk, majd 1,5 ml lízis oldatot adtunk a mintákhoz. Egy centrifugálást követően eltávolítottuk a folyadékot és 300 μl 20T-10E pufferrel finoman rázva föloldottuk a csapadékot. A mintákhoz 20 μl 20 %-os SDS-t adtunk, és vortexelés után 15 percig 70 °C-on inkubáltuk. Az oldathoz 150 μl 7,5 M-os ammónium-acetátot kevertünk, és 30 percre darált jégbe állítottuk a mintákat. Centrifugálás (10 perc, 4 C˚, 15000 rpm) után a felső tiszta réteget, körülbelül 450 μl-t átpipettáztunk egy másik steril csőbe, majd azonos mennyiségű izopropanolt adtunk hozzá, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
Újabb centrifugálás (5 perc, 4 C˚, 8000 rpm) után a folyadékot leöntöttük, és 500 μl TE pufferben a csapadékot feloldottuk. A CIA kezelést követően, 40 μl 3 M-os nátrium-acetátot valamint 1 ml etanolt adtunk a mintákhoz, majd ismét centrifugáltunk. Végül egy 70% etanolos tisztítás után kiszárítottuk a mintákat és 200 μl TE pufferben feloldottuk.
3.2.2 DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR)
A PCR reakciót minden esetben Robocycler (Stratagene, USA) készülékben hajtottuk végre. A reakciót mintánként 20µl reakció eleggyel indítottuk, amely a következő komponenseket tartalmazta:
- 25 ng templát DNS,
- 100 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP),
- 10x PCR puffer [(1 x 10mM TrisHCl (pH 8.8), 1,5 mM MgCl2, 50mM KCl és 0,1% Triton X-100)],
- 0,2 μM a primerpár mindkét tagjából (Metabion, Germany),
- 0,5 unit DynaZyme DNS polymeráz enzim (Finnzymes Oy, Finland).
A PCR profilt az alkalmazott primerek kapcsolódási hőmérsékletének és a felszaporítani kívánt termékek méretének megfelelően választottuk meg.
3.2.2.1 A kloroplasztisz és mitokondrium genom vizsgálata
A kloroplasztisz és a mitokondrium genom vizsgálatánál Al-Janabi és mtsai (1994), Demesure és mtsai (1995), Dumolin-Lapegue és mtsai (1996), Hiratsuka és mtsai (1989), Petit és mtsai (1998) és Wu és mtsai (1998) által kifejlesztett univerzális primer párokat teszteltük. Az alkalmazott 12 db kloroplasztisz és a 12 db mitokondrium genom specifikus primer pár jelölését, szekvenciáját és az alkalmazott kapcsolódási hőmérsékleteket az 1. táblázatban közöljük. A PCR profil a következő volt: 1 ciklus 94˚C 3 perc, majd ezt követte 35 cikluson át 94˚C 30 másodperc, X ˚C 1 perc, 72˚C 2 perc, a végső lánchosszabítás 72˚C 5 perc.
1. táblázat: A kloroplasztisz és a mitokondrium nem kódoló régióinak
felszaporításához alkalmazott primerek szekvenciái és kapcsolódási hőmérsékletei
Kloroplasztisz
Mitokondrium
3.2.2.2 A psbA gén felszaporítása restrikciós emésztéshez és szekvenáláshoz A psbA gént tartalmazó 1800 bp nagyságú fragmentum amplifikációját a trnH: 5’-ACGGGAATTGAACCCGCGCA-3’ és a trnK: 5’-CCGACTAGTTCCGGGTTCGA-3’ (Demesure és mtsai 1995) primerekkel végeztük. A PCR reakció profil a következő volt: 94oC 3 perc; 30 ciklus: 94oC 45 másodperc , 55oC 1 perc, 72oC 2 perc, és a végső extenzió 72oC-on 10 perc volt. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a ATGAGGGTTACAGATTTGGTC-3’ (f277) forward és a 5’-AGATTAGCACGGTTGATGATA-3’ (r277) (Cheung és mtsai 1993) reverz primerek segítségével szaporítottuk fel. A PCR reakcióhoz a következő programot alkalmaztuk:
94oC 2 perc; 30 ciklus: 94oC 5 másodperc, 50oC 10 másodperc, 72oC 30 másodperc, végül 72oC 5 percig.
A psbA gén szekvenálásához a trnK+r277 és a f277+trnH primerpárokkal is felszaporítottuk a gén két felét. A PCR profil megegyezett a trnK+ trnH primerpárnál alkalmazottal.
3.2.2.3 A psbA gén allél specifikus felszaporítása Bi-PASA (bidirectional-PCR amplification of specific alleles) primerekkel
A psbA gén 278 bp méretű mutációt tartalmazó darabját és a fogékony egyedekre jellemző 208 bp ill. a rezisztensekben felszaporodó 109 bp nagyságú fragmentumokat a
PsbaF (5’-ATGAAGGTTACAGATTCGGTC-3’), PsbaR
(5’-AAGGTTAGCACGGTTAATGATA-3’), BPMMF
(5’-ATTGATCTTCCAATATACTA-3’) és BPMMR
(5’-GAATGAGAGTTGTTGAAACC-3’) primereket egy reakcióban használva amplifikáltuk. A vastaggal szedett nukleotidok a specifikusság növelése érdekében alkalmazott nukleotod cseréket (MisMatch) jelölik. A PCR reakció az alábbiak szerint történt: 94oC 2 perc; 45 ciklus: 94oC 15 másodperc, 53oC 15 másodperc, 72oC 30 másodperc, végül 72oC 3 percig.
3.2.2.4 Az ALS-A és ALS-B fragmentum amplifikálása
Az ALS-A régió felszaporítása a forward 5’-AGCTCTGGAACGTGAAGGC-3’ és reverz 5’-CGTGTTACCTCAAGAGTTAGC-3’ (Patzoldt és mtsai 2001) primereket használva a következő PCR profillal történt: 94oC 3 perc; 35 ciklus: 94oC 30 másodperc, 57oC 1 perc, 72oC 1 perc, végül 72oC 5 perc.
Az ALS-B régióra specifikus primerek a következők voltak: F: 5'-ATGAACGTTCAAGAGTTAGC-3', R: 5'-CCTTCGGTGATCACATCCTTGAA-3' (Patzoldt és mtsai 2001). A PCR reakció profilja megegyezett az ALS-A régióéval az 53
oC-os kapcsolódási hőmérséklet kivételével.
3.2.2.5 Az Amb a I géncsalád vizsgálata specifikus primerekkel
Első lépésként Rafnar és mtsai (1991) által publikált primereket teszteltük le, melyek a következők voltak: RW38, RW45, RW32.1, RW32.2, RW32.3 (2. táblázat). A PCR reakciót az alábbi profil szerint állítottuk be: 94oC 3 perc; 5 ciklus: 94oC 30 másodperc, 65oC 1,5 perc, 72oC 4 perc, 30 ciklus: 94oC 30 másodperc, 55oC 1,5 perc, 72oC 4 perc végül 72oC 5 perc.
2. táblázat: Az Amb a I gén elejére (RW38), közepére (RW45) és végére (RW32.1, RW32.2, RW32.3) tervezett primerek (Rafnar és mtsai 1991).
Primer Nevek Primer Szekvenciák Primer Lokalizáció (nukleotidokban)
RW38 5’-TCTTGTATTTTACCTTAG-3’ 27-43
RW45 5’-ACCATCGTTGGACTTAA-3’ 540-557
RW32.1 5’-TCATTATAAGTGCTTAGT-3’ 1211-1223
RW32.2 5’-ATTATAAAAAGCTTAGG -3’ 1211-1223
RW32.3 5’-ATAGCAAAAGCTTAGGAG-3’ 1211-1223
A három génváltozat elkülönítésére irányuló vizsgálatokat a PrimerSelect (DNAStar Inc., Madison, USA) (3.táblázat) és Primer3 (Rozen és mtsai 2000) (4.
táblázat) programokkal tervezett specifikus primerekkel végeztük. A primerek megtervezéséhez használt szekvenciákat az 1. mellékletben közöljük.
3. táblázat: A PrimerSelect programmal tervezett primerek, melyek az Amb a I gén három variánsának első felén lokalizáltak.
Primer
Nevek Primer Szekvenciák Primer
Lokalizáció (nt-okban)
Kapcsolódási Hőmér. oC
(X)
Amba 1-2E 5’-ATGGGGATCAAACACTG-3’ 2-18 52
Amba 1K 5’-GGCCTCCTGGATTCACTT-3’ 516-533
Amba 1-2E 5’-ATGGGGATCAAACACTG-3’ 2-18
Amba 2K 5’-TGCCTCCTGGACAAACTT-3’ 516-533 52
Amba 3E 5’-ATGGGGATCAAACAATG-3’ 2-18
Amba 3K 5’-TGCCTCCTGGAAGCACTT-3’ 516-533 53
4. táblázat: A primer3 programmal az Amb a I.1, Amb a I.2 és Amb a I.3 génekből
A PCR során a programok által meghatározott primer kapcsolódási hőmérsékleteket (X) alkalmaztuk. A profil a következő volt: 94oC 3 perc; 35 ciklus: 94oC 30 másodperc, XoC 1 perc, 72oC 2 perc a végső extenzió 72 oC 5 perc.
3.2.3 Restikciós enzimek használata
3.2.3.1A kloroplasztisz és mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP vizsgálata
A restrikciós emésztésekhez 10 µl PCR terméket használtunk fel. Az enzimekből 10 unitot kevertünk a mintákhoz és 4 órára vízfürdőbe helyeztük őket. A Taq I restrikciós enzimnél 65oC-os, a BstU I-nél 60 oC-os az Aci I, Dde I, EcoR I, Hae III, Hha I, Mse I és az Rsa I-es restrikciós endonukleáznál 37 oC-os hőmérsékletet alkalmaztunk a gyártó (New England Biolabs, US) leírása szerint.
3.2.3.2 A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek
A PCR termékekből 10 µl-t használtunk az emésztésekhez. A BstXI-es endonukleázból 8 unitot adtunk a mintákhoz, a MaeI-esből 3 unitot. Az emésztéseket 4 órán át 50oC-on ill. 45 oC-on végeztük.
3.2.4 DNS elválasztás gélelektroforézissel és értékelés
A különböző méretű DNS fragmentumok elválasztására horizontális agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk. A PCR és a restrikciós termékeket 1,5%-os agaróz (Promega, USA) gélen, a heteroplazmásság vizsgálatakor 2,5%-os Metaphor (Cambrex, USA) gélen 0,5xTBE pufferben választottuk szét (220V 1,5 óra). A géleket 20 percig
ethidium-bromidot tartalmazó TE pufferben (85µl/1000ml) festettük. A kapott mintázatot, a Syngene GeneGenius géldokumentációs rendszerével detektáltuk és értékeltük. A fragmentumok méretét 50 bp-os és 100 bp-os súlymarkerhez (Fermentas, Litvánia) viszonyítottuk.
3.2.5 DNS fragmentumok tisztítása gélből
Az izolálni kívánt fragmentumokat a transilluminátorra helyezett gélből steril szikével kimetszettük, majd a NovaGene SpinPrep Gel DNA Kit (Novagene, USA) segítségével tisztítottuk a gyártó útmutatása szerint.
3.2.6 Klónozás és szekvenálás
A klónozáshoz a pGEM-T Easy Vector System-et (Promega, USA) használtuk a gyártó leírása szerint. Első lépésként steril, IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) és X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside) tartalmú ampicillines LB táptalajt és SOC tápoldatot készítettünk.
Egy liter LB táptalaj a következőket tartalmazta:
- 10 g Bacto-tryptone - 5 g Bacto-yeast kivonat - 5 g NaCl
- 0.1 g Ampicillin - 0.119 g IPTG - 0.08 g X-Gal
100 ml SOC tápoldatot az alábbi alkotóelemekből állítottunk össze:
- 2 g Bacto-tryptone - 0.5 g Bacto-yeast kivonat - 1 ml 1M NaCl
- 0,25 ml 1M KCl - 1 ml 2M Mg2+
- 1 ml 2M Glükóz
Ezt követte a gélből izolált fragmentumok ligálása a plazmidba.
A ligálási reakcióelegy a következőket tartalmazta:
- 5 µl 2X Rapid Ligation puffer
A JM109-es kompetens sejtek transzformálása és a transzformánsok kiválogatása a következő módon történt. A ligálási reakcióelegyből 2 µl-t egy steril 1,5 ml-es eppendorf csőbe mértünk és a jégen felolvasztott JM109-es kompetens sejteket tartalmazó szuszpenzióból 50 µl-t adtunk a mintákhoz. Húsz percig jégen tartottuk a csöveket, majd pontosan 47 másodpeces 42oC-os hősokkot alkalmaztunk. Ezután 2 percre ismét jégre helyeztük a mintákat. A transzformált sejteket is tartalmazó szuszpenzióhoz 950 µl SOC tápoldatot kevertünk, majd másfél órán át 37oC-on 150 rpm-el rázattuk a csöveket. Lamináris bokszban az egyes mintákból 100-100 µl-t kentünk szét két petricsészébe, amelyek az ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajt tartalmazták. A petricsészéket egy éjszakán át 37 oC-on inkubáltuk. Másnap a fehér színű telepeket kolónia PCR-el ellenőriztük és egyben átoltottuk egy új ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajra. A kolónia PCR a klónozó helyre specifikus primerekkel történt T7: TAATACGACTCACTATAGGG-3', SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3' 50oC-os primer kapcsolódási hőmérsékleten. A megfelelő méretű inzertet tartalmazó telepekből egyet belemostunk egy 2ml-es eppendorf csőbe, amely 1,5 ml SOC tápoldatot tartalmazott. A csöveket 37oC-on egy éjszakán át rázattuk. Az így keletkezett sejtkultúrából a plazmidokat az EZ-10 Spin column plasmid DNA Kit-el (Biotechnology Department Bio Basic Inc., Canada) izoláltuk a gyártó leírása szerint. Az izolált plazmid DNS oldatot ismét leellenőriztük a T7 és SP6 primerekkel. A megfelelő inzertet tartalmazó mintákat szekvenáltattuk. A szekvenálás a 3100 Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, USA) történt, melyet a Biomi Kft. végzett el.
3.2.7 A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése
A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP viszgálatánál kapott restrikciós fragmentumok jelenlétét 1-esel a hiányát 0-ával jelöltük. Az így kapott binomiális mátrixot a Treecon 1.3b softver (Van de Peer és De Wachter 1994)
segítségével elemeztük. Kiszámoltuk a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrixot, majd ez alapján UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) dendogrammot készítettünk. A restrikciós fragmentumokból kapott adatmátrixon nem végeztük el a bootstrap analízist, mert a restrikciós fragmentumok egymástól nem függetlenek, mivel egyetlen nukleotid csere egy fragmentum elvesztését vagy két új fragmentum keletkezését eredményezheti, így a bootstrap analízis téves eredményre vezetne (Felsenstein 2007).
A szekvenálásból kapott ABI fájlok szekvencia adatait a SeqMan (DNAStar Inc., Madison, USA) program segítségével illesztettük egymáshoz és határoztuk meg a pontmutációkat ill. a kódoló szekvenciák által meghatározott aminosavsorrendet.
A nukleotid és aminosav szintű homológia kereséseket a BLAST program (Altschul és mtsai 1990) segítségével a http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html internetes oldalon végeztük el.
4. Eredmények
4.1 A parlagfű populációgenetikai viszgálata PCR-RFLP módszerrel fejlesztett anyai öröklésű markerek segítségével
Az univerzális primer párok tesztelése során a felszaporított Cp és Mt nem kódoló régiók mérete 250 és 3000 bp között volt (5. táblázat). A cpDNS vizsgálatánál 12 univerzális primerpárt teszteltünk le ebből 4 primerpárral kaptunk az összes mintánál egyetlen terméket. Ezeket a kloroplasztisz fragmentumokat bevontuk az RFLP vizsgálatokba és 9 restrikciós enzimmel emésztettük. A mtDNS összehasonlításánál 12 primerpárral kísérleteztünk, ebből 7-tel kaptunk terméket, de a cobf - cobr és a rps14f - rps14r primerpárokkal felszaporítható mtDNS fragmentumok mérete csupán 250-300 bp volt. Ezeken a kisebb termékeken nem végeztük el a 8 enzimmel a restrikciós emésztéseket, mert csak kevés vágási helyre számíthattunk.
5. táblázat: A felszaporított kloroplasztisz és mitokondrium régiók mérete
psbC2-trnS1 1 1600 18S-5S 1 1000
trnS2-trnfM 1 1200 nad5a f-nad5 r 1 1000
trnS4-trnT3 1 1500 nad5d f-nad5d r 1 1000
trnF-trnV 1 3000 nad1B-nad1C 1 950
trnK f-trnK r több nad4exon1-nad4exon2a 1 2000
trnQ-trnR több cob f-cob r 1 300
rpoC1-rpoC2 több rps14 f-rps14 r 1 250
trnD-trnT1 több atp6 f-atp6 r nincs
rbcL1 –rbcL2 több cox1 f-cox1 r nincs
psaA –trnS4 több nad3 f-nad3 r nincs
TrnV -rbcL több nad4exon2b-nad4exon3 nincs
tmT2 –psbC2 nincs rps14-cob nincs
A PCR-RFLP során a psbC2-trnS1, trnS2-trnfM, trnS4-trnT3 és trnF-trnV primerpárokkal felszaporított Cp régiók hossza összesen 7.300 bp volt. A vizsgált Mt régiók mérete összesen 5.950 bp, melyeket a 18S-5S, nad5af-nad5r, nad5df-nad5dr, nad1B-nad1C és nad4exon1-nad4exon2a primerekkel amplifikáltunk. A restrikciós enzimekkel végzett kezelések után, a mintákat agaróz gélen választottuk el és digitálisan dokumentáltuk a gélfotókat (6. ábra).
Cp: trnS2+trnfM, emésztve MseI-el Mt: Nad5d F+R, emésztve RsaI-el
6. ábra: PCR-RFLP vizsgálatok agaróz elektroforetogrammjai. Minták: Emésztett fragmentum: 0, K-Magyarország (Hódmezővásárhely): 1, 2, 13, 14; Ny-Magyarország (Keszthely): 3, 4, 15, 16; USA: 5, 6, 7, 8; Kanada: 9, 10, 11, 12;
Napraforgó: 17, 18; 100 bp-os DNS marker: M.
Az emésztések utáni különböző méretű termékek számát a kloroplasztisz és mitokondrium régiók emésztése során a parlagfűben a napraforgóban és a két növényben együtt vizsgálva a 6/a és 6/b táblázatok foglalják össze.
6/a táblázat: A kloroplsztisz régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok számát mutatja.
6/b táblázat: A mitokondrium régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok számát mutatja.
A napraforgó és a parlagfű cpDNS-ét összehasonlítva 36 emésztésből 17-szer, ami 47%-nak felel meg a mtDNS emésztésénél 41-ből 19-szer, ami 46%-ot jelent, eltérő számú és/vagy méretű restrikciós fragmentumokat kaptunk. A konzerváltabb Cp genomnál a restrikciós fragmentumok száma összesen 213 volt a két fajban. A parlagfüvekben 134 különböző emésztési terméket találtunk ebből 15 (11,2%) bizonyult
polimorfnak. A napraforgókkal összehasonlítva, további 79 polimorf fragmentum keletkezett. A jobban rekombinálódó mitokondriális DNS-ben 224 különböző emésztési terméket tudtunk összeszámolni. A parlagfűben az emésztések során 173 termék keletkezett, és ezek közül 32 (18,5%) bizonyult polimorfnak. Még további 15 polimorf fragmentumot találtunk a napraforgó mintákat is vizsgálva.
A genetikai távolságmátrix alapján szerkesztett dendogram (7. ábra) jól szemlélteti, hogy a két napraforgó teljesen elkülönült a parlagfüvektől. A parlagfű populációk két csoportra váltak szét az USA-ból származó egyedek egymással szoros kapcsolatot mutattak, de a többi egyedtől elkülönültek.
7. ábra: UPGMA dendogram, a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrix alapján a Treecon 1.3b programmal (Van de Peer és De Wachter 1994) szerkesztve.
A hármas és négyes számú Hódmezővásárhely környéki parlagfű két kanadai mintához állt a legközelebb. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak.
4. 2 Herbicid célgének és rezisztenciát okozó mutációk jellemzése a parlagfűben
4.2.1Az atrazin-rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata
A psbA gént szenzitív és atrazin rezisztens parlagfüvekből is izoláltuk a trnH+trnK primerekkel. A PCR reakciók során a gént is tartalmazó 1800 bp méretű terméket kaptunk. A szekvenálás megkönnyítése érdekében ezt a fragmentumot két részletben is felszaporítottuk a trnK+r277 és a trnH+f277 primereket használva. A szekvenálást ezen a két fragmentumon és a mutáció helyét tartalmazó belső fragmentumon - amit a f277+r277 primer párral amplifikáltunk - is elvégeztük. A három szenzitív és a három rezisztens parlagfű psbA génjének nukleotid-sorrendje nem különbözött egymástól, csupán egyetlen bázispár eltérést találtunk a rezisztens egyedekben, a 790-es pozícióban (7. ábra). Ez a pontmutáció a szakirodalomban közölt más növényekhez hasonlóan a parlagfűben is egy adenin/guanin csere, ami szerin/glicin aminosav váltást okoz a D1 fehérjében az atrazin kötődési helyén.
8. ábra: A psbA gén szekvenciája az atrazin rezisztens parlagfűben. A szekvencia elején a start (ATG) a végén a stop (TAA) kódon aláhúzva. A rezisztenciáért felelős nukleotid
“G”, aminek a pozíciójában a szenzitív típusban adenin található, bekeretezve látható.
A CTAG nukleotidok alatti csillagok jelölik a második MaeI vágási helyet. A szürkével kiemelt szekvenciák a belső 277 bp méretű fragmentum primerjei, az aláhúzással az univerzális primerektől való eltérést jelöltük.
A Cheung és mtsai (1993) által tervezett primer párral a várt 277 bp méretű, a pontmutációt tartalmazó belső régiót sikerült felszaporítanunk, annak ellenére, hogy mindkét primerben két nukleotid eltérés van a parlagfű szekvenciához viszonyítva (8.
ábra). A parlagfű szekvenciának megfelelő primereket szintetizáltattunk, azonban ezekkel is ugyanazt az eredményt kaptuk, mint a Cheung féle primerekkel.
A D1 fehérje aminosav-sorrendje nagyon konzervált a magasabb rendű növények között. Ennek ellenére a genetikai kód degenerációja miatt, a mutációk hatására lehet nukleotid szinten különbségeket kimutatni a psbA génben. A homológiakeresés eredményét a 7. táblázat tartalmazza. Látható, hogy az 1062 bp nagyságú génben a több tízes nagyságrendű nukleotid eltérések nem vagy csak néhány aminosav megváltozását okozzák. Ennek magyarázata a genetikai kód „lötyögése” és a D1 fehérje fontos szerepe a fotoszintézisben, amit csak a megfelelő fehérje-szerkezettel tud ellátni.
7. táblázat: A parlagfű psbA génjének az összehasonlítása több növényfaj psbA génjével.
psbA ORF Promóter 5’UTR
Nukleotidok Aminosavak Nukleotidok Nukleotidok
Ls 10 0 9 1
So 46 0 11 22
Nt 41 0 13 20
Ms 60 4 22 14
At 52 1 27 13
Bn 48 2 27 24
Gm 74 2 27 20
Hv 77 6 27 26
Os 90 4 29 22
A számok az eltérő nukleotidokat és aminosavakat jelzik az A. artemisiifolia L.
szekvenciájától. ORF: open reading frame; 5’UTR: 5’-untranslated region. Ls: Lactuca sativa, So: Spinacea oleracea, Nt: Nicotiana tabacum, Ms: Medicago sativa, At:
Arabidopsis thaliana, Bn: Brassica napus, Gm: Glycine maxima, Hv: Hordeum vulgare, Os: Oryza sativa.
Az Ambrosia artemisiifolia promótere is tartalmazza a ”-10” és a “-35” konzervált elemeket, valamint ezek között megtalálható a prokariótákra jellemző TGn motívum és az eukariótákra jellemző TATA box (9a ábra). A promóter központi részén kívüli regió kevésbé konzervált.
9. ábra: A parlagfű psbA génjének promóter (a) és 5’UTR (b) szekvenciájának az összehasonlítása más növényfajokéval. Szürkével az azonos nukleotidokat jelöltük. A “-10” és a “-35” konzervált elemeket a promóterben és a riboszóma kötődési helyeket az 5’UTR-ben aláhúzással jelöltük. A növényfajok jelölése azonos az 7. táblázattal.
A psbA gén 5’UTR-e a parlagfűben 75 nukleotid hosszú. A szekvenciában számos eltérés felfedezhető a többi magasabb rendű növényhez képest is (9b ábra). A homológia körülbelül 70%-os, de a saláta (Lactuca sativa) 5’UTR szekvenciája mindössze egyetlen nukleotidban különbözik. A három riboszóma-kötődési helyben nem tér el az Ambrosia artemisiifolia 5’UTR-e sem a többi vizsgált növényétől.
4.2.1.1 A psbA gén rezisztens és fogékony alléljának kimutatása
A heteroplazmásság vizsgálatánál a BstXI és a MaeI restrikciós enzimeket alkalmaztuk. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a rezisztens egyedekben a BstXI enzim a pontmutációnál elvágja, és egy 87 bp és egy 190 bp méretű terméket eredményez (10. ábra).
10. ábra: A psbA gén belső 277 bp nagyságú fragmentuma, a BstXI enzimmel történt emésztés után. Az első 6 minta rezisztens egyedből származik, a többi 18 minta szenzitívből. M: 50 bp-os súlymarker.
A fogékony egyedekben nem vág a BstXI enzim. A szekvencia adatok azt mutatták, hogy a MaeI-es enzimnek két vágási helye van a fogékony egyedekben. Az első független a rezisztenciától, míg a második a rezisztenciát okozó mutáció helyén található. Ezért ezzel az enzimmel a szenzitív típusban három darab restrikciós fragmentumot (154 bp, 88 bp, 35 bp) kapunk, a rezisztens egyedekben pedig csak kettőt (154 bp, 123 bp) ( 11. ábra).
11. ábra: A 277 bp méretű fragmentum sematikus emésztési képe a szenzitív és a rezisztens genotípusban a MaeI és a BstXI enzimekkel. A számok a restrikciós fragmentumok méretét jelölik bázispárban.
Az emésztések elvégzése után (12. ábra) azt tapasztaltuk, hogy a rezisztens egyedeknél a BstXI-es emésztés után mindig marad emésztetlen 277 bp méretű termék. Ez a jelenség független volt a restrikciós enzim koncentrációjától.
12. ábra: Hat szenzitív és hat rezisztens növény restrikciós emésztési képe BstXI-es (A szenzitív egyedekben nincs vágási hely, a rezisztensekben egy 190 bp és egy 87 bp nagyságú termék látható.) és MaeI-es enzimekkel (A szenzitívekben 154 bp, 88bp és 35 bp a rezisztensekben 154 és 123bp méretű termék látható) . A kép jobb szélén 50 bp-os marker (M) látható.
Az emésztés után megmaradt 277 bp méretű terméket kivágtuk és visszatisztítottuk a gélből. Ezt a DNS-t használva templátként megismételtük a PCR reakciót a f277+r277 primerekkel. A kapott terméket a MaeI-es enzimmel emésztve érdekes módon megkaptuk a szenzitív és a rezisztens szekvenciákra jellemző méretű restrikciós fragmentumokat és egy 189 bp méretű fragmentumot is (13. ábra).
13. ábra: A heteroplazmásság kimutatása hat atrazin rezisztens mintán. A BstXI enzimes emésztés után az emésztetlen 277 bp méretű terméket kivágtuk a gélből és visszatisztítottuk a DNS-t, a PCR után MaeI-el emésztettük a termékeket. Egyszerre látható az atrazin rezisztens típusra jellemző fragmentum (123 bp) és a szenzitív növényekre jellemző fragmentumok (154 bp, 88 bp és 35 bp). A kép bal szélén egy emésztés előtti 277-es fragmentum, a jobb szélén az 50 bp-os marker látható.
13. ábra: A heteroplazmásság kimutatása hat atrazin rezisztens mintán. A BstXI enzimes emésztés után az emésztetlen 277 bp méretű terméket kivágtuk a gélből és visszatisztítottuk a DNS-t, a PCR után MaeI-el emésztettük a termékeket. Egyszerre látható az atrazin rezisztens típusra jellemző fragmentum (123 bp) és a szenzitív növényekre jellemző fragmentumok (154 bp, 88 bp és 35 bp). A kép bal szélén egy emésztés előtti 277-es fragmentum, a jobb szélén az 50 bp-os marker látható.