A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek

A PCR termékekből 10 µl-t használtunk az emésztésekhez. A BstXI-es endonukleázból 8 unitot adtunk a mintákhoz, a MaeI-esből 3 unitot. Az emésztéseket 4 órán át 50^oC-on ill. 45 ^oC-on végeztük.

3.2.4 DNS elválasztás gélelektroforézissel és értékelés

A különböző méretű DNS fragmentumok elválasztására horizontális agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk. A PCR és a restrikciós termékeket 1,5%-os agaróz (Promega, USA) gélen, a heteroplazmásság vizsgálatakor 2,5%-os Metaphor (Cambrex, USA) gélen 0,5xTBE pufferben választottuk szét (220V 1,5 óra). A géleket 20 percig

ethidium-bromidot tartalmazó TE pufferben (85µl/1000ml) festettük. A kapott mintázatot, a Syngene GeneGenius géldokumentációs rendszerével detektáltuk és értékeltük. A fragmentumok méretét 50 bp-os és 100 bp-os súlymarkerhez (Fermentas, Litvánia) viszonyítottuk.

3.2.5 DNS fragmentumok tisztítása gélből

Az izolálni kívánt fragmentumokat a transilluminátorra helyezett gélből steril szikével kimetszettük, majd a NovaGene SpinPrep Gel DNA Kit (Novagene, USA) segítségével tisztítottuk a gyártó útmutatása szerint.

3.2.6 Klónozás és szekvenálás

A klónozáshoz a pGEM-T Easy Vector System-et (Promega, USA) használtuk a gyártó leírása szerint. Első lépésként steril, IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) és X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside) tartalmú ampicillines LB táptalajt és SOC tápoldatot készítettünk.

Egy liter LB táptalaj a következőket tartalmazta:

- 10 g Bacto-tryptone - 5 g Bacto-yeast kivonat - 5 g NaCl

- 0.1 g Ampicillin - 0.119 g IPTG - 0.08 g X-Gal

100 ml SOC tápoldatot az alábbi alkotóelemekből állítottunk össze:

- 2 g Bacto-tryptone - 0.5 g Bacto-yeast kivonat - 1 ml 1M NaCl

- 0,25 ml 1M KCl - 1 ml 2M Mg²⁺

- 1 ml 2M Glükóz

Ezt követte a gélből izolált fragmentumok ligálása a plazmidba.

A ligálási reakcióelegy a következőket tartalmazta:

- 5 µl 2X Rapid Ligation puffer

A JM109-es kompetens sejtek transzformálása és a transzformánsok kiválogatása a következő módon történt. A ligálási reakcióelegyből 2 µl-t egy steril 1,5 ml-es eppendorf csőbe mértünk és a jégen felolvasztott JM109-es kompetens sejteket tartalmazó szuszpenzióból 50 µl-t adtunk a mintákhoz. Húsz percig jégen tartottuk a csöveket, majd pontosan 47 másodpeces 42^oC-os hősokkot alkalmaztunk. Ezután 2 percre ismét jégre helyeztük a mintákat. A transzformált sejteket is tartalmazó szuszpenzióhoz 950 µl SOC tápoldatot kevertünk, majd másfél órán át 37^oC-on 150 rpm-el rázattuk a csöveket. Lamináris bokszban az egyes mintákból 100-100 µl-t kentünk szét két petricsészébe, amelyek az ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajt tartalmazták. A petricsészéket egy éjszakán át 37 ^oC-on inkubáltuk. Másnap a fehér színű telepeket kolónia PCR-el ellenőriztük és egyben átoltottuk egy új ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajra. A kolónia PCR a klónozó helyre specifikus primerekkel történt T7: TAATACGACTCACTATAGGG-3', SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3' 50^oC-os primer kapcsolódási hőmérsékleten. A megfelelő méretű inzertet tartalmazó telepekből egyet belemostunk egy 2ml-es eppendorf csőbe, amely 1,5 ml SOC tápoldatot tartalmazott. A csöveket 37^oC-on egy éjszakán át rázattuk. Az így keletkezett sejtkultúrából a plazmidokat az EZ-10 Spin column plasmid DNA Kit-el (Biotechnology Department Bio Basic Inc., Canada) izoláltuk a gyártó leírása szerint. Az izolált plazmid DNS oldatot ismét leellenőriztük a T7 és SP6 primerekkel. A megfelelő inzertet tartalmazó mintákat szekvenáltattuk. A szekvenálás a 3100 Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, USA) történt, melyet a Biomi Kft. végzett el.

3.2.7 A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése

A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP viszgálatánál kapott restrikciós fragmentumok jelenlétét 1-esel a hiányát 0-ával jelöltük. Az így kapott binomiális mátrixot a Treecon 1.3b softver (Van de Peer és De Wachter 1994)

segítségével elemeztük. Kiszámoltuk a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrixot, majd ez alapján UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) dendogrammot készítettünk. A restrikciós fragmentumokból kapott adatmátrixon nem végeztük el a bootstrap analízist, mert a restrikciós fragmentumok egymástól nem függetlenek, mivel egyetlen nukleotid csere egy fragmentum elvesztését vagy két új fragmentum keletkezését eredményezheti, így a bootstrap analízis téves eredményre vezetne (Felsenstein 2007).

A szekvenálásból kapott ABI fájlok szekvencia adatait a SeqMan (DNAStar Inc., Madison, USA) program segítségével illesztettük egymáshoz és határoztuk meg a pontmutációkat ill. a kódoló szekvenciák által meghatározott aminosavsorrendet.

A nukleotid és aminosav szintű homológia kereséseket a BLAST program (Altschul és mtsai 1990) segítségével a http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html internetes oldalon végeztük el.

4. Eredmények

4.1 A parlagfű populációgenetikai viszgálata PCR-RFLP módszerrel fejlesztett anyai öröklésű markerek segítségével

Az univerzális primer párok tesztelése során a felszaporított Cp és Mt nem kódoló régiók mérete 250 és 3000 bp között volt (5. táblázat). A cpDNS vizsgálatánál 12 univerzális primerpárt teszteltünk le ebből 4 primerpárral kaptunk az összes mintánál egyetlen terméket. Ezeket a kloroplasztisz fragmentumokat bevontuk az RFLP vizsgálatokba és 9 restrikciós enzimmel emésztettük. A mtDNS összehasonlításánál 12 primerpárral kísérleteztünk, ebből 7-tel kaptunk terméket, de a cobf - cobr és a rps14f - rps14r primerpárokkal felszaporítható mtDNS fragmentumok mérete csupán 250-300 bp volt. Ezeken a kisebb termékeken nem végeztük el a 8 enzimmel a restrikciós emésztéseket, mert csak kevés vágási helyre számíthattunk.

5. táblázat: A felszaporított kloroplasztisz és mitokondrium régiók mérete

psbC2-trnS1 1 1600 ^18S-5S 1 1000

trnS2-trnfM 1 1200 nad5a f-nad5 r 1 1000

trnS4-trnT3 1 1500 nad5d f-nad5d r 1 1000

trnF-trnV 1 3000 nad1B-nad1C 1 950

trnK f-trnK r több nad4exon1-nad4exon2a 1 2000

trnQ-trnR több cob f-cob r 1 300

rpoC1-rpoC2 több rps14 f-rps14 r 1 250

trnD-trnT1 több atp6 f-atp6 r nincs

rbcL1 –rbcL2 több cox1 f-cox1 r nincs

psaA –trnS4 több nad3 f-nad3 r nincs

TrnV -rbcL több nad4exon2b-nad4exon3 nincs

tmT2 –psbC2 nincs ^rps14-cob nincs

A PCR-RFLP során a psbC2-trnS1, trnS2-trnfM, trnS4-trnT3 és trnF-trnV primerpárokkal felszaporított Cp régiók hossza összesen 7.300 bp volt. A vizsgált Mt régiók mérete összesen 5.950 bp, melyeket a 18S-5S, nad5af-nad5r, nad5df-nad5dr, nad1B-nad1C és nad4exon1-nad4exon2a primerekkel amplifikáltunk. A restrikciós enzimekkel végzett kezelések után, a mintákat agaróz gélen választottuk el és digitálisan dokumentáltuk a gélfotókat (6. ábra).

Cp: trnS2+trnfM, emésztve MseI-el Mt: Nad5d F+R, emésztve RsaI-el

6. ábra: PCR-RFLP vizsgálatok agaróz elektroforetogrammjai. Minták: Emésztett fragmentum: 0, K-Magyarország (Hódmezővásárhely): 1, 2, 13, 14; Ny-Magyarország (Keszthely): 3, 4, 15, 16; USA: 5, 6, 7, 8; Kanada: 9, 10, 11, 12;

Napraforgó: 17, 18; 100 bp-os DNS marker: M.

Az emésztések utáni különböző méretű termékek számát a kloroplasztisz és mitokondrium régiók emésztése során a parlagfűben a napraforgóban és a két növényben együtt vizsgálva a 6/a és 6/b táblázatok foglalják össze.

6/a táblázat: A kloroplsztisz régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok számát mutatja.

6/b táblázat: A mitokondrium régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok számát mutatja.

A napraforgó és a parlagfű cpDNS-ét összehasonlítva 36 emésztésből 17-szer, ami 47%-nak felel meg a mtDNS emésztésénél 41-ből 19-szer, ami 46%-ot jelent, eltérő számú és/vagy méretű restrikciós fragmentumokat kaptunk. A konzerváltabb Cp genomnál a restrikciós fragmentumok száma összesen 213 volt a két fajban. A parlagfüvekben 134 különböző emésztési terméket találtunk ebből 15 (11,2%) bizonyult

polimorfnak. A napraforgókkal összehasonlítva, további 79 polimorf fragmentum keletkezett. A jobban rekombinálódó mitokondriális DNS-ben 224 különböző emésztési terméket tudtunk összeszámolni. A parlagfűben az emésztések során 173 termék keletkezett, és ezek közül 32 (18,5%) bizonyult polimorfnak. Még további 15 polimorf fragmentumot találtunk a napraforgó mintákat is vizsgálva.

A genetikai távolságmátrix alapján szerkesztett dendogram (7. ábra) jól szemlélteti, hogy a két napraforgó teljesen elkülönült a parlagfüvektől. A parlagfű populációk két csoportra váltak szét az USA-ból származó egyedek egymással szoros kapcsolatot mutattak, de a többi egyedtől elkülönültek.

7. ábra: UPGMA dendogram, a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrix alapján a Treecon 1.3b programmal (Van de Peer és De Wachter 1994) szerkesztve.

A hármas és négyes számú Hódmezővásárhely környéki parlagfű két kanadai mintához állt a legközelebb. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak.

4. 2 Herbicid célgének és rezisztenciát okozó mutációk jellemzése a parlagfűben

4.2.1Az atrazin-rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata

A psbA gént szenzitív és atrazin rezisztens parlagfüvekből is izoláltuk a trnH+trnK primerekkel. A PCR reakciók során a gént is tartalmazó 1800 bp méretű terméket kaptunk. A szekvenálás megkönnyítése érdekében ezt a fragmentumot két részletben is felszaporítottuk a trnK+r277 és a trnH+f277 primereket használva. A szekvenálást ezen a két fragmentumon és a mutáció helyét tartalmazó belső fragmentumon - amit a f277+r277 primer párral amplifikáltunk - is elvégeztük. A három szenzitív és a három rezisztens parlagfű psbA génjének nukleotid-sorrendje nem különbözött egymástól, csupán egyetlen bázispár eltérést találtunk a rezisztens egyedekben, a 790-es pozícióban (7. ábra). Ez a pontmutáció a szakirodalomban közölt más növényekhez hasonlóan a parlagfűben is egy adenin/guanin csere, ami szerin/glicin aminosav váltást okoz a D1 fehérjében az atrazin kötődési helyén.

8. ábra: A psbA gén szekvenciája az atrazin rezisztens parlagfűben. A szekvencia elején a start (ATG) a végén a stop (TAA) kódon aláhúzva. A rezisztenciáért felelős nukleotid

“G”, aminek a pozíciójában a szenzitív típusban adenin található, bekeretezve látható.

A CTAG nukleotidok alatti csillagok jelölik a második MaeI vágási helyet. A szürkével kiemelt szekvenciák a belső 277 bp méretű fragmentum primerjei, az aláhúzással az univerzális primerektől való eltérést jelöltük.

A Cheung és mtsai (1993) által tervezett primer párral a várt 277 bp méretű, a pontmutációt tartalmazó belső régiót sikerült felszaporítanunk, annak ellenére, hogy mindkét primerben két nukleotid eltérés van a parlagfű szekvenciához viszonyítva (8.

ábra). A parlagfű szekvenciának megfelelő primereket szintetizáltattunk, azonban ezekkel is ugyanazt az eredményt kaptuk, mint a Cheung féle primerekkel.

A D1 fehérje aminosav-sorrendje nagyon konzervált a magasabb rendű növények között. Ennek ellenére a genetikai kód degenerációja miatt, a mutációk hatására lehet nukleotid szinten különbségeket kimutatni a psbA génben. A homológiakeresés eredményét a 7. táblázat tartalmazza. Látható, hogy az 1062 bp nagyságú génben a több tízes nagyságrendű nukleotid eltérések nem vagy csak néhány aminosav megváltozását okozzák. Ennek magyarázata a genetikai kód „lötyögése” és a D1 fehérje fontos szerepe a fotoszintézisben, amit csak a megfelelő fehérje-szerkezettel tud ellátni.

7. táblázat: A parlagfű psbA génjének az összehasonlítása több növényfaj psbA génjével.

psbA ORF Promóter 5’UTR

Nukleotidok Aminosavak Nukleotidok Nukleotidok

Ls 10 0 9 1

So 46 0 11 22

Nt 41 0 13 20

Ms 60 4 22 14

At 52 1 27 13

Bn 48 2 27 24

Gm 74 2 27 20

Hv 77 6 27 26

Os 90 4 29 22

A számok az eltérő nukleotidokat és aminosavakat jelzik az A. artemisiifolia L.

szekvenciájától. ORF: open reading frame; 5’UTR: 5’-untranslated region. Ls: Lactuca sativa, So: Spinacea oleracea, Nt: Nicotiana tabacum, Ms: Medicago sativa, At:

Arabidopsis thaliana, Bn: Brassica napus, Gm: Glycine maxima, Hv: Hordeum vulgare, Os: Oryza sativa.

Az Ambrosia artemisiifolia promótere is tartalmazza a ”-10” és a “-35” konzervált elemeket, valamint ezek között megtalálható a prokariótákra jellemző TGn motívum és az eukariótákra jellemző TATA box (9a ábra). A promóter központi részén kívüli regió kevésbé konzervált.

9. ábra: A parlagfű psbA génjének promóter (a) és 5’UTR (b) szekvenciájának az összehasonlítása más növényfajokéval. Szürkével az azonos nukleotidokat jelöltük. A “-10” és a “-35” konzervált elemeket a promóterben és a riboszóma kötődési helyeket az 5’UTR-ben aláhúzással jelöltük. A növényfajok jelölése azonos az 7. táblázattal.

A psbA gén 5’UTR-e a parlagfűben 75 nukleotid hosszú. A szekvenciában számos eltérés felfedezhető a többi magasabb rendű növényhez képest is (9b ábra). A homológia körülbelül 70%-os, de a saláta (Lactuca sativa) 5’UTR szekvenciája mindössze egyetlen nukleotidban különbözik. A három riboszóma-kötődési helyben nem tér el az Ambrosia artemisiifolia 5’UTR-e sem a többi vizsgált növényétől.

4.2.1.1 A psbA gén rezisztens és fogékony alléljának kimutatása

A heteroplazmásság vizsgálatánál a BstXI és a MaeI restrikciós enzimeket alkalmaztuk. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a rezisztens egyedekben a BstXI enzim a pontmutációnál elvágja, és egy 87 bp és egy 190 bp méretű terméket eredményez (10. ábra).

10. ábra: A psbA gén belső 277 bp nagyságú fragmentuma, a BstXI enzimmel történt emésztés után. Az első 6 minta rezisztens egyedből származik, a többi 18 minta szenzitívből. M: 50 bp-os súlymarker.

A fogékony egyedekben nem vág a BstXI enzim. A szekvencia adatok azt mutatták, hogy a MaeI-es enzimnek két vágási helye van a fogékony egyedekben. Az első független a rezisztenciától, míg a második a rezisztenciát okozó mutáció helyén található. Ezért ezzel az enzimmel a szenzitív típusban három darab restrikciós fragmentumot (154 bp, 88 bp, 35 bp) kapunk, a rezisztens egyedekben pedig csak kettőt (154 bp, 123 bp) ( 11. ábra).

11. ábra: A 277 bp méretű fragmentum sematikus emésztési képe a szenzitív és a rezisztens genotípusban a MaeI és a BstXI enzimekkel. A számok a restrikciós fragmentumok méretét jelölik bázispárban.

Az emésztések elvégzése után (12. ábra) azt tapasztaltuk, hogy a rezisztens egyedeknél a BstXI-es emésztés után mindig marad emésztetlen 277 bp méretű termék. Ez a jelenség független volt a restrikciós enzim koncentrációjától.

12. ábra: Hat szenzitív és hat rezisztens növény restrikciós emésztési képe BstXI-es (A szenzitív egyedekben nincs vágási hely, a rezisztensekben egy 190 bp és egy 87 bp nagyságú termék látható.) és MaeI-es enzimekkel (A szenzitívekben 154 bp, 88bp és 35 bp a rezisztensekben 154 és 123bp méretű termék látható) . A kép jobb szélén 50 bp-os marker (M) látható.

Az emésztés után megmaradt 277 bp méretű terméket kivágtuk és visszatisztítottuk a gélből. Ezt a DNS-t használva templátként megismételtük a PCR reakciót a f277+r277 primerekkel. A kapott terméket a MaeI-es enzimmel emésztve érdekes módon megkaptuk a szenzitív és a rezisztens szekvenciákra jellemző méretű restrikciós fragmentumokat és egy 189 bp méretű fragmentumot is (13. ábra).

13. ábra: A heteroplazmásság kimutatása hat atrazin rezisztens mintán. A BstXI enzimes emésztés után az emésztetlen 277 bp méretű terméket kivágtuk a gélből és visszatisztítottuk a DNS-t, a PCR után MaeI-el emésztettük a termékeket. Egyszerre látható az atrazin rezisztens típusra jellemző fragmentum (123 bp) és a szenzitív növényekre jellemző fragmentumok (154 bp, 88 bp és 35 bp). A kép bal szélén egy emésztés előtti 277-es fragmentum, a jobb szélén az 50 bp-os marker látható.

Ebből az eredményből arra következtetünk, hogy a psbA gén triazin rezisztenciát okozó változata heteroplazmásan van jelen az általunk vizsgált rezisztens egyedekben, azaz egy növényben a psbA génre nézve többféle kloroplasztisz genotípus található. A 189 bp (154 bp + 35 bp) méretű termék megjelenése az első MaeI vágási hely hiányának köszönhető, mely kloroplasztisz genotípus nyomokban (heteroplazmásan) fordul elő a vizsgált rezisztens parlagfű mintákban. A fogékony egyedekben is megpróbáltuk kimutatni a psbA gén rezisztens változatát, de ezek a próbálkozásaink nem hoztak egyértelmű eredményt, valószínűleg a nagyon kis kópiaszám miatt (az adatokat nem közöltük).

A rezisztenciát okozó pontmutációt tartalmazó régióra bi-PASA primereket terveztünk (14. ábra). A BPMMF és BPMMR primerek szekvenciájának megtervezésekor mindkét primerben egy-egy nukleotid cserét (MisMatch) alkalmaztunk, a reakció specifikusságának növelése érdekében. Ezekkel a primerekkel egy PCR reakcióban lehetséges a fogékony és a rezisztens genotípusra jellemző fragmentum felszaporítása. Kimutatható, ha egy mintában jelen van a rezisztens és a szenzitív genotípus is.

5’ATGAAGGTTACAGATTCGGTCAAGAAGAAGAAACTTATAATATCGTAGCCGCTCATGGTT ATTTTGGCCGATTGATCTTCCAATATGCTA/GGTTTCAACAACTCTCGTTCTTTACATTTCTTC CTAGCTGCTTGGCCTGTAGTAGGTATCTGGTTCACTGCTTTAGGTATCAGTACTATGGCTTTC AACCTAAATGGTTTCAATTTCAACCAATCAGTAGTTGATAGTCAAGGCCGTGTTATTAACAC TTGGGCTGATATCATTAACCGTGCTAACCTT3’

PsbaF: 5’-ATGAAGGTTACAGATTCGGTC-3’ - sötétszürke PsbaR 5’-AAGGTTAGCACGGTTAATGATA-3’- sötétszürke BPMMF: 5’-ATTGATCTTCCAATATACTA-3’- szürke BPMMR: 5’-GAATGAGAGTTGTTGAAACC-3’- szürke

14. ábra: A bi-PASA primerek tervezéséhez felhasznált parlagfű psbA gén szekvencia részlet és a megtervezett primerek szekvenciái. Vastagbetűvel a rezisztenciáért felelős nukleotidot és a primerekben alkalmazott MisMatch-et (nukleotid cserét) jelöltük.

A PCR-es kísérletet elvégeztük 6 rezisztens és 6 szenzitív egyeden és az elektroforézis után azt az eredményt kaptuk, hogy a rezisztens egyedek tartalmazzák a szenzitív genotípust is (15. ábra). A rezisztens és szenzitív egyedekben is megjelent a 278 bp nagyságú termék, amely a PsbaF és PsbaR primerekkel szaporodott fel. A rezisztens genotípusra jellemző 109 bp nagyságú fragmentum, amely szintézisének a PsbaF és BPMMR primerek az indító szekvenciái, csak a rezisztens egyedekben amplifikálódott. A szenzitív kloroplasztisz genotípusokban a PsbaR és BPMMF primerektől kiindulva 208 bp nagyságú termék szaporodik fel, melyet a rezisztens és a szenzitív fenotípusú egyedekben is ki tudtunk mutatni. A bi-PASA PCR eredményei azt mutatják, hogy a triazin rezisztens parlagfüvekben a psbA gén rezisztens és szenzitív változata is megtalálható.

15. ábra: A bi-PASA primerekkel elvégzett PCR reakció termékeinek az elektroforetogrammja. Az első hat minta rezisztens, ezekben amplifikálódott a várt 278 bp-os régió és a rezisztens genotípusra specifikus 109 bp-os termék és a szenzitív genotípusra jellemző 208 bp-os fragmentum is. A második hat minta szenzitív fenotípusú és csak a 278 bp-os régió és a fogékony genotípusra specifikus 208 bp mértű termék szaporodott fel.

4.2.2 Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata

Az ALS gén vizsgálatához az ALS-A régiót felszaporítottuk a Patzoldt és mtsai (2001) által közölt primerekkel és közvetlenül szekvenáltuk. Ez a régió tartalmaz az öt toleranciáért felelős mutáció közül hármat (Ala122/Thr, Pro197/Ser, Ala205/ Val). Az általunk vizsgált hat magyarországi, és egy kanadai parlagfű, valamint viszonyítási alapként használt egy napraforgó minta ALS-A szekvenciáját a 16. ábrán közöljük.

16. ábra: Az A regió 264 nukleotid méretű szakasza, amely tartalmaz három ALS-gátló rezisztenciáért felelős pontmutációt.

Az aminosav szekvenciában a három rezisztenciát okozó mutációt fekete színnel jelöltük (Ala122/Thr, Pro197/Ser, Ala205/Val). A hódmezővásárhelyi 2. sz. minta aminosav sorrendjében a detektált mutációt beszürkítettük (Ile192/Asp192). A nukleotid szintű polimorfizmusokat beszürkítettük. A polimorf nukleotidok jelentése a konszenzus szekvenciában: W=A/T, Y=C/T.

Egyik minta sem tartalmazta a rezisztenciáért felelős mutációkat, de a hódmezővásárhelyi 2-es parlagfűben a 224-es nukleotidnál egy timin/adenin csere következett be, ami izoleucin/aszparaginsav aminosav cserét eredményez.

Tranel és mtsai (2004) 24 amerikai parlagfű egyed ALS-A szekvenciáját közölték, ahol 24 mintán összesen 32 nukleotid polimorfizmust detektáltak. Ezekkel az adatokkal hasonlítottuk össze az általunk vizsgált hat magyarországi és egy kanadai parlagfű minta, valamint egy napraforgó szekvenciáját (8. táblázat).

8. táblázat: Polimorfizmusok az ALS-A régió 264 nukleotidja alapján.

Faj Gyűjtési hely Növények méretű régióban. A két hódmezővásárhelyi mintában összesen öt egyedi polimorfizmust találtunk, míg a többi hazai mintában található nukleotid cserék az amerikai mintákban is előfordultak.

Az ALS-B régiókat PCR-el felszaporítottuk, majd klónoztuk és a teljes régió szekvenciáját meghatároztuk a napraforgó és a négy parlagfű mintában. A szekvenálás eredménye 17. ábrán látható. Ebben a régióban két ALS-gátlókra rezisztenciát okozó mutáció lehetséges (Trp574/Leu, Ser653/Thr), melyek közül egyik sem volt megtalálható az ALS-B szekvenciákban. A Ser653/Ala aminosav cserét minden vizsgált egyedben kimutattuk, melyet Patzoldt és mtsai (2001) is felfedeztek amerikai parlagfüvekben, de ez nem okozott rezisztenciát az ALS-gátló herbicidekkel szemben.

17. ábra: Az ALS-B regió 365 nukleotidja, amely tartalmazza a két ALS-gátló rezisztenciáért felelős pontmutációt. Az aminosav szekvenciában a két rezisztenciáért felelős mutációt fekete színnel jelöltük (Trp574/Leu574, Ser653/Thr653). A keszthelyi 2. sz.

minta aminosav sorrendjében a detektált két mutációt beszürkítettük ( Ala624/Val624, Ile640/Val640). A nukleotid polimorfizmusokat beszürkítettük. A polimorf nukleotidok jelentése a konszenzus szekvenciában: R=A/G, Y=C/T. A régió felszaporításához alkalmazott primereket sötétszürke szín jelöli.

A keszthelyi 2-es számú mintában a 245-ödik és a 292-edik nukleotidnál bekövetkezett pontmutációk aminosav cserét is eredményeztek. Így az aminosav sorrendben alanin/valin és izoleucin/valin váltás következett be (16. ábra). Az ALS-A és ALS-B régióban az egy parlagfűre eső polimorf nukleotidok száma nagyságrendileg azonos volt. A napraforgó ALS-B szekvenciában 21 nukleotid eltérés volt a parlagfű szekvenciákhoz képest (8. és 9. táblázat), ez négyszer annyi, mint az ALS-A régió esetében.

9. táblázat: Polimorfizmusok az ALS-B régió 365 nukleotidja alapján.

Faj Gyűjtési hely Növények

A Rafnar és mtsai (1991) meghatározták az Amb a I gén cDNS szekvenciáját és három génváltozatot írtak le. Ezt a gént ill. változatait kívántuk kimutatni magyarországi parlagfüvekben. A vizsgálatokat Rafnar és mtsai (1991) által a gén elejére, közepére és végére tervezett specifikus primerekkel kezdtük el. A gén első felét valószínűleg sikerült amplifikálnunk 5 magyarországi parlagfűből az RW38 és RW45 primerekkel (18. ábra), de a kódoló cDNS szekvenciától eltérően nem 530 bp méretű terméket kaptunk, hanem egy 630 bp-osat. Nagy valószínűséggel 100 bp méretű intron található a gén első felében, vagy más genomi régióból történt az amplifikáció. A gén egészének felszaporítása nem sikerült az RW38 és RW32.1, RW32.2 és RW32.3 primer-kombinációkkal sem.

18. ábra: Az Amb a I gén cDNS szekvenciájának első felére tervezett primerekkel (RW38+RW45: Rafnar és mtsai 1991) felszaporított termék elektroforetogrammja.

Az Amb a I gén három változatára specifikus primerek (Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K, Amba3E+Amba3K), amiket a PrimerSelect programmal terveztünk a gén ugyanazon részét amplifikálják, mint az RW38+RW45 primerpár. A cDNS szekvencia alapján várt fragmentum 532 bp méretű volt. A PCR reakciók elvégzése után azt tapasztaltuk, hogy mind a három primer kombináció számos nem specifikus termék mellett felszaporított egy kb. 630 bp méretű főterméket is, hasonlóan az RW38+RW45 primerpárhoz (19. ábra). Az Amba1-2E+Amba2K és Amba3E+Amba3K primer párokkal kapott termékek 20-30 bp-ral nagyobbak voltak a

Az Amb a I gén három változatára specifikus primerek (Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K, Amba3E+Amba3K), amiket a PrimerSelect programmal terveztünk a gén ugyanazon részét amplifikálják, mint az RW38+RW45 primerpár. A cDNS szekvencia alapján várt fragmentum 532 bp méretű volt. A PCR reakciók elvégzése után azt tapasztaltuk, hogy mind a három primer kombináció számos nem specifikus termék mellett felszaporított egy kb. 630 bp méretű főterméket is, hasonlóan az RW38+RW45 primerpárhoz (19. ábra). Az Amba1-2E+Amba2K és Amba3E+Amba3K primer párokkal kapott termékek 20-30 bp-ral nagyobbak voltak a

In document A parlagfű gyombiológiai valamint egészségügyi szempontból leglényegesebb tulajdonságainak molekuláris genetikai vizsgálata (Pldal 43-0)