A tormaperoxidáz enzim kompresszibilitása

esett a választásunk, mivel ez egy nyomás-denaturációval szemben stabilnak mutatkozó hem-fehérje. A magnézium-mezoporfirinnel helyet–

tesített torma–peroxidázt mértük. A helyettesítésre a vas-porfirin fluoreszcencia élettarta–mának rövidsége miatt volt szükség, ami nagy homogén kiszélesedéshez vezet, ezért a vas-porfirin alkalmatlan FLN mérésekre. A helyettesített hem-fehérjéknek az a további előnyük, hogy a fluoreszcens porfirin a fehérje aktív helyéről, annak környezetéről nyújt információt.

A magnézium-mezoporfirinnel helyet–tesített tormaperoxidázt

(MgMP-HRP) 1,6 mmol/l

koncentrációban oldottuk fel pH7-es foszfát pufferben, és utána az előző fejezetben leírtaknak megfelelően a gyémánt cellában 10 K-en mértük az

FLN spektrumokat a nyomás 33. ábra A MgMP-HRP IDF-jei néhány kiválasztott nyomáson.

függvényében. A minta átlátszóságának biztosítása végett 50% glicerint is tartalmazott, ami nem befolyásolja a fehérje szerkezetét (Fidy és mtsai, 1992). Bár a tormaperoxidáz kivételesen nagy nyomásstabilitással rendelkező fehérje, minden esetben a már kriogenikus hőmérsékletre hűtött mintát nyomtuk össze, hogy elkerüljük a nyomás által szobahőmérsékleten okozott konformációs változásokat. A 33. ábra mutatja az IDF-eket néhány nyomásértéken. A görbe egy domináns komponenst mutat, bár az eloszlásgörbe két szélén nagyon kis amplitúdójú komponensek jelenléte kétségtelen. Ezeket Balog és mtsai (2000) az MgMP nemspecifikus kötődésével magyarázták. Ezek tehát a jelen munka szempontjából nem lényegesek és ezért a továbbiakban csak a fő komponensre fordítjuk figyel–

münket. A nulla nyomáson mért IDF jelentősen keskenyebb mint a szerves mátrixba ágyazott kromofór esetében, félérték-félszélessége 25 cm^-1. A kromofór tehát sokkal jobban meghatározott környezetben helyezkedik el a fehérje-zsebben, mint a szerves oldószerben. A nulla nyomáson mért IDF pozíciója és szélessége megfelel a korábbi irodalmi méréseknek.

A 4.4.1. fejezetben kimunkált elméleti leírásnak megfelelően (27 és 28 egyenletek) az IDF-ek eltolódnak, és egyben ki is szélesednek a nagy nyomás hatására. A nyomás függvényében ábrázolt maximum pozíciók pontjai (34. ábra) jól illeszkednek egy egyenesre, aminek a meredeksége 67±3 cm^-1/GPa. Ezt és a már korábban említett irodalmi vákuum frekvenciát felhasználva a tormaperoxidáz kompresszibilitására κ = 0.066±0.003 GPa^-1 adódik.

34. ábra. A MgMP-HRP IDF-jének maximum pozíciója a nyomás függvényében

Az irodalomban eddig két olyan mérést közöltek, amely a tormaperoxidáz kompresszibilitására vonatkozott. Ezek az adatok a mostani eredményünkkel együtt az V. táblázatban vannak összefoglalva. A három mérés eltérő technikával, ill.

körülmények között történt. A jelen mérések eredményeként kapott érték kisebb, mint az ugyancsak kriogenikus hőmérsékleten, de nagyságrendekkel kisebb

nyomástartományban SHB-vel mért érték, de megegyezik a szobahőmérsékleten ultrahangsebesség-mérésekből számított értékkel. Az ultrahangos mérések az adiabatikus kompresszibilitást adják, amiből a κT = κS + α²T/ρ Cp formulával kell kiszámolni az izotermikus kompresszibilitást (α a hőtágulási együttható, ρ a sűrűség, Cp az állandó nyomáson mért fajhő). Az ultrahangos mérések az alkalmazott nyomás (hangnyomás) szempontjából az alacsony nyomás tartományába esnek.

Az FLN és az SHB kompresszibilitási adatok eltérését úgy értelmezhetjük, hogy a kompresszibilitás a kis (néhány MPa) és a nagy (100MPa-GPa) nyomás tartományokban eltérő. Ennek megértéséhez figyelembe kell venni a fehérje szerkezetét. A fehérje összenyomása valójában nem teljesen izotróp módon történik.

A fehérje összenyomásakor a másodlagos és harmadlagos szerkezet deformációjával a fehérjében levő üregek térfogata csökkenhet. A nagy nyomáson mért kisebb kompresszibilitást úgy értelmezzük, hogy ezek az üregek „elfogytak”, és a további kompresszió ezáltal nagyobb energiát ill. nyomást igényel. Modellünk szerint a fehérjében kompresszibilisebb és kevésbé kompresszíbilis tartományok (domének) vannak. Kis nyomás hatására főleg a flexibilisebb, azaz könnyebben összenyomható domének térfogata változik, amely nagyobb kompresszibilitást eredményez. Nagy V. Táblázat.

A tormaperoxidáz különböző módszerekkel meghatározott izotermikus kompresszi–

bilitása

κ kísérleti körülmények

Módszer [GPa] T[K] p[GPa] forrás

FLN 0,066 10 0.1-1,7 jelen munka (P11 saját cikk) SHB 0,106 1,5 0-0,0011 Balog és mtsai (1997) Ultrahang 0,067 298 NA* Gekko és Hasegawa (1986)

* Az ultrahangos mérésekben alkalmazott hangnyomásról nincs közvetlen adat, de a hasonló mérések alapján valószínűsíteni lehet, hogy ez nem nagyobb mint 0,1 MPa.

nyomáson ezek a domének már teljesen összenyomott állapotban vannak, így az egyöntetűen kompakttá vált szerkezet további összenyomása nehezebb, ezért kapunk nagy nyomáson kisebb kompresszibilitást. Ezt mutatja a 35. ábra sematikusan. Az FLN és az ultrahangos mérések egybeesését a véletlennek tudjuk be, úgy gondoljuk, hogy a hőmérséklet és a nyomástartomány különbözőségének hatása kiegyenlítette egymást.

Összefoglalva, a tormaperoxidáz kompresszibilitását 10 K-en a 0,1-1,7 GPa tartományban 0,066 GPa^-1–nak találtuk. Eredményeinket összevetettük a sokkal kisebb nyomástartományban végzett SHB és ultrahangos mérésekből kapott kompresszibilitás értékekkel. Az eltérést eltérő kompresszibilitású fehérjedomének jelenlétével magyaráztuk. Eszerint a fehérje flexibilisebb doménjei alacsony nyomáson nagyobb deformációt mutatnak, és ez vezet a nagyobb kompresszibilitás értékhez. Modellünk szerint a nyomás növelésével először a nagyobb kompresszibilitású (flexibilisebb) domének nyomódnak össze, mialatt a rigidebb domének szerkezete csak kissé deformálódik. Nagy nyomáson a flexibilis régiók már teljesen össze vannak nyomva, és merevvé válnak, azaz az egész fehérje merev, kis kompresszibilitású lesz. Modellünk alapján azt állapítottuk meg, hogy a tormaperoxidázban eltérő flexibilitású fehérjedomének vannak.

35. ábra Az eltérő kompresszibilitású domének összenyomódása alacsony és nagy nyomás hatására. Kis nyomáson csak az összenyomható domén térfogata csökken, majd miután ez teljesen összenyomódott, a további összenyomódás homogén.

4. 5. A hő-, nyomás-, és hidegdenaturált fehérjeállapotok összehasonlítása FTIR spektroszkópiával és termodinamikai analízissel. (T5, P12)

A hideg- és hődenaturált fehérjeszerkezetek összehasonlítása tekintetében az irodalom ellentmondásos volt. A nyomás-denaturált és a másik két módon kigombolyodott fehérje-konformáció összehasonlítása hiányzott az irodalomból.

FTIR spektroszkópiai mérésekkel hasonlítottuk össze a lószív mioglobin hő-, nyomás-, és hidegdenaturált állapotait. A mioglobint pD8,2 Tris-DCl pufferben oldottuk 75mg/ml koncentrációban. A nyomás- és hideg-denaturációt a gyémánt cellában mértük, a hődenaturációt pedig CaF2 ablakkal ellátott küvettában.

4.5.1. A natív szerkezet