A szója lipoxigenáz

A 2D korrelációs spektroszkópiát ezután egy olyan fehérjére alkalmaztuk, ahol a vizsgált nyomástartományban nemcsak elasztikus, hanem konformációs változások (denaturáció) is várhatóak voltak. A szója lipoxigenáz a BPTI-vel ellentétben egy kimondottan nagy fehérje, amely 839 aminosavból áll, 22 alfa-hélixet és egy 8 polipeptid szakaszból álló béta-lemezes szerkezetet tartalmaz (Gaffney, 1996, Minor és mtsai, 1996). Mivel az enzim az élelmiszerek lebontási folyamataiban vesz részt (Hendrickx és mtsai, 1998), nyomás-inaktiválását egy élelmiszeripari EU projekt keretében vizsgáltuk. A nyomástartományt három részre osztottuk, a denaturációhoz kapcsolódó konformációs változásokat még nem mutató 0,23-0,44 GPa-os szakaszra, a konformációs változások tartományára (0,45-0,9 GPa) és a már denaturált állapotú polipeptidláncot tartalmazó felső 0,85-1,06 GPa tartományra. A felosztás alapja az amid I sáv maximumának a nyomás függvényében történő szigmoid függvényt követő eltolódása, amelynek átmeneti pontja a 0,65 GPa-nál volt (Heinisch és mtsai 1995).

Az alsó nyomástartományban (0,23-0,44 GPa) csak nagyon kis szerkezetváltozásra utaló jelet láttunk (19. ábra) , ami az amid II’ sáv 1437 cm^-1-es sávjával korrelál. A korrelációs spektrumok amplitúdói itt egy nagyságrenddel kisebbek, mint a 0,47-0,90 GPa tartományban (20. ábra). Az alacsony nyomástartományban megjelenő amid I és amid II’ keresztcsúcsok az amid II jelek hiányával együtt azt mutatják, hogy a már H/D kicserélődésen átesett fehérjeszakaszok konformációja változik kis mértékben.

A mérés előtt ugyanis a minta kb. 15 órán (egy éjszakán) át D2O-ban (pontosabban pD 7.8 Tris pufferben) volt feloldva, megteremtve ezzel annak a lehetőségét, hogy az oldószerrel érintkező hidrogének kicserélődjenek. A 1620 cm^-1-nél megjelenő

keresztcsúcsok az intermolekuláris kölcsönhatások megváltozására is utalnak.

Ismeretes ugyanis, hogy a fehérjék aggregációját a nyomás gátolja (Silva és Weber 1988, Silva és mtsai, 2001). Figyelemre méltó a lipoxigenáz alacsony nyomású, és a BPTI nagy nyomású szimmetrikus 2D ábráinak hasonlósága. Mindkét esetben a már H/D kicserélt szerkezet deformációja megy végbe további H/D kicserélődés nélkül.

A lipoxigenáz esetében már alacsony nyomáson van olyan része a proteinnek, ahol a kicserélődés végbement, ami arra utal, hogy a térszerkezet egy része kevésbé merev, mint a BPTI-nél, és így a fehérje egy része már atmoszferikus nyomáson kicserélődik, míg a merev BPTI esetében ehhez a kicserélődéshez is nagy nyomásra van szükség.

A legnagyobb amplitúdójú változások a 2D spektrumokon is a 0,45-0,9 GPa nyomástartományban voltak. Fehérjeszerkezet-változásra és H/D kicserélődésre utaló komponensek egyaránt megfigyelhetők voltak a szinkron és aszinkron 2D spektrumokon. A natív struktúrához tartozó másodlagos szerkezeti komponensek 19. ábra. A szója lipoxigenáz 0,23-0,44 GPa között mért infravörös spektrumaiból számított 2D korrelációs spektrumok. Bal oldalon a szimmetrikus, jobb oldalon az aszimmetrikus ábra. A felső és bal oldali téglalapokban a referencia spektrum abszorbanciája van ábrázolva a ν1 ill. ν2 függvényében. A negatív tartományok kékkel vannak jelölve.

csökkenését a 1655 cm^-1-es csúcs csökkenése mutatja, mely az alfa-helikális struktúra eltűnését jelenti. Ezzel korrelál az amid II (1541 cm^-1) sáv csökkenése, és mindkettővel antikorrelálnak az egyidejűleg növekvő amid II’ komponensek (1475 és 1424 cm^-1). A 2D analízis által szolgáltatott sorrend a következő volt: 1620 (első)

> 1475 > 1655 > 1540 cm^-1 (utolsó). Mivel a 1620 cm^-1-es komponens már az előző nyomástartományban is jelen volt, nem meglepő, hogy ennek a változása történt először. Ennek köszönhető az is, hogy az amid II’ sáv előbb jelenik meg, mint az amid II, pedig ezek megjelenését egyszerre várnánk. A fehérje szerkezetét alapvetően befolyásoló 1655 cm^-1-es sáv az amid II és II’ változások közé ékelődik, ami azt mutatja, hogy a másodlagos szerkezet változása nagyon szoros korrelációban van a kicserélődéssel.

Megállapíthatjuk tehát, hogy a fehérjének van egy belső magja, amelyikben a helikális szerkezet dominál, és amely annyira kompakt, sűrűn hajtogatott szerkezetű, hogy az amid hidrogének a fehérjének ebben a részében atmoszferikus nyomáson natív állapotban még 15 óra alatt sem képesek kicserélődni. Erre csak a másodlagos szerkezet széttekeredésekor kerül sor.

20. ábra. A szója lipoxigenáz 0,47-0,90 GPa között mért infravörös spektrumaiból számított 2D korrelációs spektrumok. Bal oldalon a szimmetrikus, jobb oldalon az aszimmetrikus ábra. A negatív tartományok kékkel jelöltek.

A legfelső nyomástartományban, ahol a fehérje már denaturált állapotban van, a 2D spektrumokon megjelenő gyenge csúcsokból (21. ábra) azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a széttekeredett fehérjében nyomokban még mindig jelen vannak bizonyos másodlagos szerkezeti komponensek. Ebben a tartományban a maximális amplitúdójú keresztcsúcsok még a 0,23-0,44 GPa tartományban találtnál is egy kettes faktorral kisebbek, ami nagyon kis szerkezeti átalakulásra utal. A denaturált fehérjében nyomokban meglévő másodlagos szerkezetek részarányának további

nyomásnövekedés hatására történő csökkenését és a rendezetlen konformáció további növekedését kaptuk a 2D spektrumok alapján.

A H/D kicserélődés időtől való függését is analizáltuk a 2D korrelációs spektrumok segítségével. 0,52 és 0,73 GPa nyomásokon végeztünk kinetikai méréseket, nyomásugrás után követve a kinetikát. A nyomást a gyémánt cellában úgy növeltük, hogy ez ne vezessen jelentős adiabatikus melegedéshez. A gyémánt jó hővezető-képessége és a minta kis térfogata miatt ez biztosított volt. A nyomásugrást követő 2 órában az idő függvényében felvett spektrumokból számoltuk ki a 2D korrelációs spektrumokat (22. ábra). Most a nyomás helyett az időt tekintettök a „perturbáló 21. ábra. A szója lipoxigenáz 0,85-1,06 GPa között mért infravörös spektrumaiból számított 2D korrelációs spektrumok. Baloldalon a szimmetrikus, jobb oldalon az aszimmetrikus ábra. A negatív tartományok kékkel jelöltek.

paraméternek” (ld. 3.3. fejezet). A kinetikai 2D spektrumok alapján megállapítottuk, hogy a 0,52

GPa-on már megindulnak

konformációs változások és a 2D spektrumokon ezek a konfor-mációs változások dominálnak.

Jelentős kicserélődési effektust azonban nem tapasztalunk a spektrumokon. Ebből arra lehet következtetni, hogy először a fehérje kevésbé rigid, a víz által elérhető doménjei szenvednek konformáció-változást. A 2D szinkron spektrumban a 0,73 GPa-os mérésnél megjelenő kereszt-csúcsok arra utalnak, hogy a kicserélődés és a konformáció-változás ebben a nyomás-tartományban korrelált. Ez megint azt a korábbi megállapításunkat erősíti meg, hogy a fehérjének van egy belső, nem flexibilis magja, amely csak a kitekeredés után érhető el a víz számára.

Összegezve tehát a 2D korrelációs

analízissel megállapítható, hogy a fehérjének van egy olyan része, amely normál körülmények között is elérhető az oldószer számára, itt a H/D kicserélődés 15 óra alatt teljesen lezajlik. Létezik azonban egy belső merevebb mag, amely csak a denaturációval egyidejűleg válik elérhetővé, és ebben a H/D kicserélődés csak a kitekeredéssel együtt járó konformációs változásokkal együtt zajlik le. Méréseink szerint a merev maghoz főleg hélix szerkezet tartozik.

22. ábra. A szója lipoxigenáz 0,52 (a) ill. 0,73 (b) GPa nyomáson az idő függvényében mért infravörös spektrumaiból számolt 2D szimmetrikus korrelációs spektrumok. A negatív tartományokat kék szín jelöli.

4. 3. A nyomás-denaturácót követő újragombolyodás során intermedier állapotok keletkeznek, melyeknek fokozott aggregációra való hajlamuk van.

(T3, P7, P10)

Az eddigiekben a fehérjék összenyomásakor fellépő effektusokat tanulmányoztuk.

Most a nyomás-denaturációt követő, a denaturációs nyomásciklus után kialakuló fehérjestruktúrákat vizsgáljuk. Tulajdonképpen ezek egyfajta (re)folding vizsgálatok, ahol a nagy nyomást, mint denaturáló ágenst használjuk.