A marha hasnyálmirigy tripszin inhibitor (BPTI)

A nagy nyomású infravörös spektroszkópiai módszert ezután a marha hasnyálmirigy tripszin inhibitor (bovine pancreatic trypsin inhibitor, BPTI) szerkezetének a nyomás függvényében történő vizsgálatára használtuk. Azt szerettük volna eldönteni, hogy az irodalomban akkor megjelent molekuláris dinamikai számolásokban (Kitchen és mtsai, 1992, Brunne és Gunsteren 1993) talált kiemelkedően nagy nyomásstabilitás csak a túl rövid szimuláció következménye, vagy a stabilitásnak molekulaszerkezeti

okai vannak.

A fehérjét pD 8,6 Tris/DCl pufferben oldottuk fel 16 mM koncentrációban.

Az oldatot este készítettük el, hogy éjszaka a hidrogén-deutérium kicserélődés az oldószer által elérhető fehérjeszakaszokon végbemenjen. Az oldatot a gyémánt cellába töltve infravörös méréseket végeztünk a 0-1,5 GPa nyomástartományban, a nyomást a BaSO4 983 cm^-1-es vonalával mértük (ld. 3.1. fejezet).

A spektrumot a már ismertetett Fourier-öndekonvolúciós és görbe–

illesztéses módszerrel dolgoztuk fel.

A dekonvolúciót 19 cm^-1 félérték–

szélességű Lorentz görbével végeztük, ami az apodizációt is figyelembe véve 1,6-szoros felbontásnövelést tett lehetővé. A 13. ábra mutatja a BPTI atmoszferikus nyomáson mért amid I sávját dekonvolúció után az illesztett Gauss komponensekkel.

A IV. Táblázat foglalja össze az illesztéssel meghatározott másodlagos szerkezeti elemek arányát. Eredményünket összevetettünk a különböző technikák (Raman-13. ábra. A BPTI atmoszferikus

nyomáson mért spektrumának dekonvolvált amid I sávja az illesztett Gauss komponensekkel.

szórás, röntgen-krisztallográfia, vibrációs cirkuláris dikroizmus) által szolgáltatott értékekkel.

A többi módszerrel összevetve viszonylag sok rendezetlen szerkezetet kaptunk.

Ennek magyarázata lehet, hogy a BPTI rövid hélixei és kisméretű (két láncból álló) béta-lemez szerkezete miatt kevés az olyan aminosav, amelyik a rendezett másodlagos szerkezet belsejében helyezkedik el. A hélix végén, ill. a lemez szélein levő aminosavak ugyanis nem csatlakoznak a polipeptid lánc másik aminosavjához hidrogén híd kötéssel, hanem ehelyett a vízzel alkotnak hidrogénhidat, ugyanúgy mint a rendezetlen szerkezetű láncok. Így csak a másodlagos szerkezet belsejében elhelyezkedő C=O····H hidak adnak a másodlagos szerkezetre jellemző amid I jelet.

Eredményeink legjobban a Pancoska és mtsai által használt vibrációs cirkuláris dikroizmus (VCD) módszer eredményeivel egyeznek meg. Megjegyzendő, hogy a röntgen-krisztallográfiás eredmények sem voltak egyértelműek, ugyanis a táblázatban idézett két munkacsoport különböző kritériumokat használt a hélix definíciójához.

IV. Táblázat.

A BPTI másodlagos szerkezeti elemeinek különböző módszerekkel meghatározott százalékos megoszlása

Módszer α-hélix β-lemez hurok rendezetlen hivatkozás

Raman I 23 48 20 10 Williams (1986)

Raman II 25 46 19 10 Williams (1986)

Infravörös 46 26 13 - Lee és mtsai (1990)

faktor analízis

Röntgen- 26 45 16 14 Levit és Greer (1977)

krisztallográfia

VCD* I 19 26 14 37 Pancoska és mtsai

(1991)

VCD II 19 27 13 37 Pancoska és mtsai

(1991)

Röntgen- 14 24 17 38 Kabsch és Sander (1983)

krisztallográfia

Infravörös 23 10 22 35 jelen munka

* VCD = vibrációs cirkuláris dikroizmus

Az amid hidrogének deutériumra való kicserélődését az amid II ill. amid II’ sávok segítségével detektáltuk. Az amid II rezgés normál módusában az N-H síkbeli hajlítás dominál, ezért H/D kicserélődés esetén jelentős (mintegy 100 cm^-1-es) izotóp-eltolódást mutat. A 14. ábra mutatja az amid II sáv abszorbanciáját (a 1586 cm^-1-es sávra normálva) a nyomás függvényében. 400 MPa nyomásig az amid II intenzitás rohamosan csökken, tehát hidrogén-deutérium

kicserélődés megy végbe. Az a tény, hogy az amid II sáv a mérés kezdetén még jelen volt, azzal magyarázható, hogy a fehérje belső magja annyira merev, hogy a (nehéz)víz számára nem elérhető, mert atmoszferikus nyomáson tíz óra alatt sem történt meg a teljes kicserélődés. Ehhez 400 MPa nyomásra volt szükség. A nyomás fellazította a harmadlagos szerkezetet, és lehetővé tette a víz behatolását a fehérje 14. ábra. A BPTI amid II sávjának (a 1586-os

csúcshoz viszonyított) amplitúdójának változása a nyomás függvényében, az első nyomásciklus során. A betétábra a dekon–

volvált spektrum amid II vonalát mutatja.

p [GPa]

15. ábra. A BPTI amid I sávjára illesztett Gauss komponensek százalékos területarányai a nyomás függvényében. A minta előzőleg egy 0,5 GPa-s nyomáscikluson esett át, amely során a H/D csere megtörtént.

Az üres körök az 1,5 GPa nyomás leengedése utáni mérések.

belsejébe. Fontos megjegyezni, hogy a fehérje oldatban van, tehát a nyomás izotróp, a víz bepréselése csak úgy érthető, hogy a bejutó víz olyan üregeket tölt meg, amelyek eddig túl kicsik voltak egy vízmolekulának, de a harmadlagos szerkezet megváltozása lehetővé tette a víz bejutását. Így egy jobban illeszkedő, szorosabban pakolt, azaz kisebb össztérfogatú rendszer alakul ki. A 400 MPa-os ciklus után a fehérje amid I sávja nem volt teljesen reverzíbilis, a hélix és a rendezetlen szerkezethez tartozó komponensek tolódtak el, mindegyik az alacsonyabb frekvenciák felé, ami egybecseng a H/D kicserélődéssel járó effektív tömeg növekedéssel.

A 400 MPa-os nyomásciklus után a már teljesen H/D kicserélt fehérjét egy másik, 1,5 GPa-ig tartó nyomásciklusnak vetettük alá (15. ábra). A másodlagos szerkezet változása 800 MPa felett kezdődött. A legnagyobb változás a béta-szerkezethez rendelhető 1627 cm^-1-es komponens növekedése volt a rendezetlen szerkezet rovására. Egyidejűleg a minta turbiditása is megnőtt. Ezek az adatok felvetették a fehérjeasszociáció lehetőségét is, amely az infravörös méréseknél szükséges, viszonylag nagy koncentráció miatt lehetséges. (Mai tudásunk alapján ez valószínűtlen, mivel egybehangzó mérések mutatják, hogy az intermolekuláris béta-lemez szerkezetű fehérjeasszociáció nagy nyomás alatt gátolt, ill. az erre jellemző infravörös markervonalak nem a 1627 cm^-1-nél, hanem jóval alacsonyabb (1616 cm^-1) hullámszámnál találhatóak. Másik lehetőségként a röntgen-krisztallográfiai szerkezetben megfigyelhető két nagy huroknak a béta lemezhez való kapcsolódásával lehetett a spektrális változásokat magyarázni. A nyomás teljesen reverzibilisen változtatta meg a térszerkezetet, azaz a nyomás megszüntetése után az infravörös komponensek frekvenciája és relatív intenzitása visszatért az eredeti értékre. A 0,7 GPa és 1,4 GPa közti tartományban a

rendezetlen + α−hélix ' β-lemez

átalakulást feltételezve a (6) egyenlettel meghatároztuk a fehérje nyomás hatására létrejövő térfogatváltozását, ami -9,5 ml/mol-nak adódott. Ez az érték jelentősen kisebb a denaturációra jellemző értékeknél, ami ismét a nyomás-denaturáció hiányát támasztotta alá.

Az eredeti kérdésünk az volt, hogy a molekuláris dinamikai számolások túl rövid ideje okozta-e, hogy nem láttak nyomás-denaturációt, vagy tényleg ilyen stabil a fehérje. A kérdésre a válasz az, hogy a fehérjében nagymértékű de reverzibilis elasztikus változások mennek végbe a 0-1 GPa nyomástartományban, de a fehérje nem denaturálódik. Ezeket az elasztikus deformációkat azonban egy elegendően hosszú szimulációnak meg kellett volna mutatnia. Ugyancsak kérdés, hogy a tirozin fluoreszcencia mérések miért nem mutattak változást 1 GPa nyomásnál? Ez utóbbi eldöntésére a fehérje tirozin gyűrűjének rezgéseit is megvizsgáltuk a nyomás függvényében.

A fehérjében négy tirozin van, amelyek aromásgyűrű-rezgései 1515 cm^-1-nél figyelhetők meg atmoszferikus nyomáson (Rahmelow és mtsai, 1998). A nyomást növelve teljesen lineáris nyomásfüggést kaptunk (16. ábra). Bár az infravörös rezgések kevésbé érzékenyek a környezet polaritásának változására, mint a fluoreszcencia intenzitás, a teljesen lineáris összefüggés arra enged következtetni, hogy a tirozinok környezete nem ment át fázisátalakulás-szerű átalakuláson, a tisztán lineáris trend a kötések fizikai kompressziójával magyarázható. A négy tirozin közül három a β-szerkezetben van, amelyik nem bomlik fel a nyomás hatására. Ez lehetett a magyarázata annak, hogy a tirozin fluoreszcencia mérések nem mutattak változást 1 GPa-nál sem.

Végezetül megvizsgáltuk még a szilárd állapotú fehérje összenyomását, ahol 1,5 GPa-ig nem találtunk semmilyen változást az infravörös spektrumban. Ebből a víz szerepének fontosságára következtettünk. Későbbi vizsgálatok is igazolták ezt a tendenciát, ti. hogy a vizet nem tartalmazó biológiai rendszerek (pl. spórák, ld. Sojka és Ludwig, 1994) nyomásstabilitása sokkal nagyobb, mint a nekik megfelelő vizes rendszereké.

16. ábra. A BPTI tirozin rezgésének eltolódása a nyomás függvényében. A fekete körök a nyomás növelésekor, az üresek a nyomáscsökkentés során mért értékeket mutatják.

Összegezve tehát megállapíthatjuk, hogy a BPTI nyomásindukált reverzibilis elasztikus szerkezetváltozáson megy keresztül, ami a molekula szerkezetét fellazítva a H/D kicserélődést a molekula magjában is lehetővé teszi. A fehérje 0,8 GPa felett konformációs változáson megy keresztül, amely azonban nem eredményezi a molekula denaturációját, és szintén reverzibilis. Mindezek a szerkezetváltozások jól követhetők a továbbfejlesztett Susi és Byler-féle módszerrel.

4. 2. A H/D kicserélődés és a konformáció-változások egymásra hatásának