A nagy nyomás

A nyomás, mint fizikai paraméter, a bevezetőben már említett okok miatt jelentősen kisebb figyelmet kapott a kutatásokban, mint a vele egyenrangú másik termodinamikai mennyiség, a hőmérséklet. A nyomásperturbáció alkalmazásának egyik úttörője Percy Williams Bridgman volt, aki a nagy nyomáson végzett méréseiért 1946-ban Nobel-díjat kapott. Nagy nyomás alatt ma a fizikában általában a 100 MPa-t (=1 kbar-t, azaz a légnyomás 1000-szeresét) meghaladó nyomásokat értik. Speciális (és drága) technikákkal ma már néhány 100 GPa is elérhető, a számomra érdekes tartomány azonban kb. 1 GPa-ig terjed, mivel ekkora nyomáson a fehérjékben már lezajlanak azok a strukturális változások, amelyeket tanulmányozni szerettem volna. Ennél nagyobb nyomáson a víz és a nehézvíz is megfagy már szobahőmérsékleten (Bridgman 1911, 1935), így a vizes oldatban levő fehérje sem vizsgálható eredeti környezetben.

2.4.1 Nagy nyomás hatása kémiai folyamatokra és azok egyensúlyára

A nyomás hatása legegyszerűbben kétállapotú rendszereken mutatható be. A nyomás hatására az ilyen rendszerek a Le Chatelier-Braun elvet követve igyekeznek a kisebb térfogatú állapotukat felvenni. Vegyünk egy egyensúlyra vezető reakciót, amely a K egyensúlyi állandóval jellemezhető. Ekkor: vonatkoztatva. Ha ∆V pozitív, akkor a termék nagyobb térfogatú, mint a kiindulási

agyag, és ebben az esetben a

negatív, azaz a nyomás növelésével az ln K és maga a K is csökken, vagyis az egyensúly a kevesebb termék irányába mozdul el.

Ha ∆V nyomástól való függése elhanyagolható, akkor:

.

ln konst

RT V

K =− p∆ + (13)

A biológiai rendszerekben végbemenő enzimatikus reakciók esetén a reakció során gyakran található egy ún. aktivált állapot (azaz egy energia-gát) amelyen a reakció folyamán áthaladunk. Ennek a kezdeti állapothoz viszonyított energiája az aktivációs energia (E^#). Hasonló módon definiálhatjuk az aktivációs térfogatot (V^#) is, ami a kezdeti állapothoz viszonyított térfogatváltozás.

Így a (13) egyenlethez hasonló összefüggés írható fel reakciósebesség és az

ahol k ill. k0 a kiindulási állapot → átmeneti komplex folyamat sebességi állandója p ill. p0 nyomáson.

Az ln K-t, ill. az ln k-t állandó hőmérsékleten a nyomás függvényében ábrázolva a meredekségből megkaphatjuk a reakció során fellépő térfogatváltozást, ill. az aktivációs térfogatot. Ez utóbbi ábra az Arrhenius ábrázolással analóg, azzal a különbséggel, hogy az aktivációs energia mindig pozitív, az aktivációs térfogat pedig akár negatív is lehet, ilyenkor a nyomás növekedése gyorsítja a reakciót.

2.4.2. Nagy nyomás hatása fehérjékre

Fehérjék esetén kétfajta folyamatot kell szemügyre vennünk, amelyeknek a nyomásfüggése érdekes lehet. Az egyik csoportba a fehérje, vagy fehérje-aggregátumok olyan konformáció-változása tartozik, amelynek során a rendszer össztérfogata megváltozik. A fehérjéket mindig vizes oldatban tanulmányoztam, így a rendszer térfogatváltozása vagy a fehérjének magának vagy fehérje és a víz kölcsönhatásának megváltozása során jöhetett létre. (Olyan folyamatok, ahol csak a

víz állapota változik, számomra nem voltak érdekesek, hiszen a fehérjéről szerettem volna információt kapni.) A fehérjék denaturációja, azaz a polipeptidlánc széttekeredése során a szerkezetet stabilizáló hidrogénhíd kötések felszakadnak, helyettük fehérje-víz hidrogénhidak jönnek létre. A fehérje kevésbé kompakt szerkezetet vesz fel, aminek következtében annak „felülete” megnő, azaz a fehérje-víz kölcsönhatás a fehérje alkotórészek (azaz aminosavak) egymás közti kölcsönhatásának rovására növekszik. Kísérleti eredmények mutatják, hogy számos fehérje denaturálható néhány száz MPa nyomáson (Bridgman,1915 Hawley 1971, Zipp és Kauzmann, 1973, Heremans, 1982, Taniguchi és Suzuki, 1983). A denaturációs nyomás természetesen fehérjéről fehérjére változik, de a kémiai környezettől (pl. pH) is függ.

Fehérje-asszociátumok oldata esetén figyelembe kell venni a fehérjék közti kölcsönhatásokat is. Így az intermolekuláris fehérje-fehérje kölcsönhatás is feliratkozik az egymással vetélkedő kölcsönhatások listájára. Tapasztalatok szerint a fehérje-aggregátumok, oligomerek túlnyomó többsége már a tipikus denaturációs nyomásnál kisebb nyomásokon disszociálódik (Silva és Weber 1988, 1993, Silva és mtsai 2001).

A fehérjékhez köthető másik típusú folyamat, amelynek nagy nyomás alatti tanulmányozása érdekes lehet: maga az enzimműködés. Tehát annak a kémiai folyamatnak a tanulmányozása, amelyet a fehérje katalizál. Ebben az esetben a reakció aktivációs térfogatát és reakció-térfogatát kapjuk meg a nyomás függvényében végzett mérések és az előző fejezetben említett termodinamikai összefüggések felhasználásával. Ehhez az egyensúlyi reakcióállandót, ill. a folyamat kinetikáját kell mérnünk a nyomás függvényében. Az aktivációs, ill. reakciótérfogat útmutatást adhat a reakció mechanizmusát illetően (ld. pl. Fanke és mtsai 2007).

2.4.3. A fehérjék Hawley-féle elliptikus nyomás-hőmérséklet fázisdiagramja Amint már említettem a fehérjék nemcsak magas hőmérsékleten, hanem nagy nyomáson is denaturálódnak. Sőt a Privalov által leírt hideg-denaturáció jelensége tovább bonyolította a helyzetet. Mindhárom denaturációra magyarázatot ad a Hawley által fenomenológiai termodinamikai leírással bevezetett elliptikus fázisdiagram

(Hawley, 1971). Az elliptikus diagram két fehérjeállapotot feltételez, a natív és a denaturált szerkezetet. Hawley a denaturáció szabadentalpia változását:

∆G = Gdenaturált – Gnatív (15) számolta ki. Egy (tetszés szerint választható) T0, p0 referencia pontból kiindulva integrálta ki a d(∆G)= -∆Sdt+∆Vdp kifejezést, ami a következő eredményre vezetett:

0 mindig az utána következő fizikai mennyiség (ugyanolyan p és T melletti) denaturált és a natív állapotbeli értékeinek különbségét jelöli.

Ez a T0-hoz közeli T értékekre érvényes

közelítés után ugyanazt a kifejezést adja, mintha a ∆G-t a nyomás és a hőmérséklet függvényében, a másodrendű tagokkal bezárólag sorbafejtenénk:

0 akkor a ∆G = 0 pontok egy elliptikus görbét adnak (6. ábra). A görbén belül a fehérje natív, míg azon kívül denaturált állapotban van. Ezt a görbét Hawley kísérletileg is kimérte két fehérjére, a kimotripszinogén és a ribonukleáz esetén. A dolog szépséghibája, hogy kísérleti berendezésével nem tudott elég nagy nyomást elérni, és így pH2-nél végezte a méréseket, azaz a pH-val mintegy elő-destabilizálta a fehérjét.

Így az ellipszis hideg vége sem nyúlt a fagypont alatti tartományba, azaz 0°C alá.

Bár az elmélet által jósolthoz hasonló görbét már több fehérjére is kimértek, nem szabad említés nélkül hagynunk a leírás hiányosságait sem. Például az a feltételezés, hogy a denaturáció reverzibilis, és hogy a többféle úton denaturált fehérjék ugyanabba a (denaturált) állapotba jutnak, drasztikus egyszerűsítés, amely még a hétköznapi tapasztalatoknak is ellentmond. (pl. a tojásfőzés sem reverzibilis folyamat!) Ugyanakkor a modell semmit sem mond a denaturáció mechanizmusáról.

A pusztán fenomenológiai modellből teljesen hiányoznak a fehérjére jellemző sajátosságok, azaz ha a termodinamikai paraméterek hasonlók, akármilyen molekuláris felépítésű rendszert le lehet vele írni. Valóban, hasonló elliptikus fázisdiagramokat kaptak folyadékkristályos rendszerek esetén, (Clark 1979, Klug és Whalley 1979), valamint egyes polimerek oldatainál (Kunugi és mtsai 1997), sőt a keményítő fázisdiagramjánál is megfigyeltek elliptikus fázishatárokat (Rubens és Heremans, 2000).) A fázisdiagram továbbfejlesztéséről még a T3, T5 és T7 tézispontokban részletesen lesz szó.

6. ábra. A Hawley-féle elliptikus fázisdiagram sematikus ábrázolása. (A c, p, h betűk a hideg, nyomás és hődenaturációt jelentik, Tsz a szobahőmérséklet).