11. A fetuin-A koncentráció vizsgálata egyéb betegségekben
11.2. A szérum fetuin-A koncentráció követése herediter angioneurotikus ödémában
A C1-inhibitor (C1-INH) hiánnyal járó herediter angioödéma (C1-INH-HANO) autoszomális domináns betegség, melyet a csökkent C1-INH aktivitás jellemez. Az esetek 80%-ában a C1-INH molekula antigénszintje alacsony (I-es típus), 20%-ában megfelelő a molekula koncentrációja, de működése csökkent (II-es típus). A C1-INH-nak fékező szerepe van a komplement, a kontakt, a véralvadási és a fibrinolitikus rendszerek szabályozásában. Hiánya ezen enzimrendszerek kontrollálatlan, spontán aktiválódásával jár. A kontakt-kinin rendszer aktiválódása a nagy molekulatömegű (HMWK) kininogénből bradykinin felszabadulásával jár. A bradykinin értágulatot, fokozott érpermeabilitást, az extracelluláris térbe történő plazmaszivárgást és ödémaképződést okoz [484-486].
A HANO-s rohamok a végtagokat, az arcot, a törzset, a genitáliákat érintik. A gyomor-béltraktus nyálkahártyájának ödémája akut hasi katasztrófát utánozhat, a felső légutakban kialakuló vizenyő pedig fulladással fenyeget. Fertőzés, mechanikus trauma, szellemi
megerőltetés, hormonális változások és gyógyszerek: ösztrogének és antiogenzin konvertáló enzim (ACE) gátlók hajlamosítanak a rohamok kialakulására [487, 488].
Újabb vizsgálati eredmények a HANO és az atherosclerosis kapcsolatára is rávilágítanak.
Demitürk és mtsai csökkent koronáriaáramlási rezervet mutattak ki HANO-s betegekben, mely mikrovaszkuláris endotheliális károsodásra utal [489], míg mások csökkent ujj-plethysmographiás mérési eredmények és aszimmetrikus dimetilarginin szintek alapján jutottak ugyanerre a következtetésre [490].
Korai vizsgálatok kimutatták a fetuin-A immunmoduláns szerepét, azaz csökkentik a PHA indukálta blasztos transzformációt [128] és fokozzák az opszonizációt és a fagocitózist [250, 491].
A fetuin-A molekula a cisztatin szupercsalád tagja [21, 26]. A cisztatinok proteináz inhibitorok. A család tagjaira cisztatin domének tandem ismétlődése jellemző (a fetuin-A-ban és B-ben, valamint a hisztidinben gazdag glikoproteinben kettő, a nagy molekulatömegű kininogénben három [21]). A fetuin-A-ban az A lánc prolinban gazdag karboxi-terminális régiójának aminosav sorrendje a C1q komplement komponens kollagénszerű doménjében találhatóra emlékeztet [18].
A fetuin-A, a C1q és a HMW kininogén közötti szerkezeti hasonlóság, valamint a fetuin-A proteolitikus érzékenysége [21] miatt találtuk érdekesnek a fetuin-A, valamint egyéb gyulladásos markerek, így a CRP és a TNFα (TNFSF2) koncentrációjának vizsgálatát HANO-s betegekben, az egészséges kontrollokhoz viszonyítva, valamint roham előtt és alatt. A szérum fetuin-A koncentrációt HANO-ban előttünk még nem vizsgálták.
11.2.1. Betegek és módszerek
Huszonöt HANO-s beteg (8 férfi, 17 nő, életkor: 31, 27–39 év, medián, Q1-Q3), 20 I-es, 5 II-es típusú HANO-s beteg rohammentes és roham alatt levett vérmintáját hasonlítottuk össze 25 egészséges kontrolléval (15 férfi, 10 nő, életkor: 30, 27–35 év). A HANO diagnózisát a családfa-analízis, a klinikai tünetek és a komplement-analízis segítségével állítottuk fel (alacsony C1-INH antigén szint és/vagy aktivitás, alacsony normális C4 és normális C1q szint). Tíz beteg tartós profilaxisban részesült (9 danazol és 1 tranexámsav).
A többi 15 beteg nem kapott profilaxist. A heveny ödémás rohamot humán plazma eredetű C1-INH koncentrátummal (Berinert, CSL Behring, Marburg, Németország) kezeltük. Az ödémás roham elhelyezkedése, valamint a tünetek jelentkezésétől a kezelésig eltelt idő a
Nemzeti HANO regiszterben került rögzítésre. A betegek közül 12-nek submucosus (közöttük 7 hasi, 2 felső légúti), 12-nek subcutan és 1-nek kevert lokalizációjú rohama volt.
A kontrollcsoportot 25 egészséges, gyógyszert nem szedő személy (10 férfi, 15 nő, életkor:
32,5 ± 7,8 év) alkotta. A betegek és az egészséges kontrollok életkora és nemi eloszlása statisztikailag nem tért el egymástól. A rohammentes időszak vérmintáit a szokásos éves kontrollvizsgálatok alkalmával, a rohamos mintákat a kezelés megkezdése előtt, a tünetek jelentkezését követő 6 órán belül vettük le. A rohamok idején egy betegnek sem volt infekcióra utaló klinikai tünete. A natív, EDTA-s és citrátos vérmintákat -70°C-on tároltuk felhasználásig.
Mindegyik paramétert a beteg ugyanazon aliquotjából határoztuk meg. Az aliquotokat egyenlő hosszúságú ideig olvasztottuk. A plazma fetuin-A és TNFα (TNFSF2) koncentrációt ELISA-val (BioVendor, Csehország, ill. Thermofisher Scientific Inc, Waltham, USA) határoztuk meg, a gyártó utasításai szerint. A CRP szintet EDTA-s vérből kémiai analizerrel (Beckman Coulter Inc., California, USA) mértük. A D-dimer koncentrációt citrátos vérből latex agglutinációs immunturbidimertiás módszerrel COAG XL koagulométeren a Dia-D-DIMER teszttel (Diagon Ltd., Budapest) határoztuk meg. A vizsgálatot a Semmelweis Egyetem Regionális, Intézményi Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága hagyta jóvá.
11.2.2. Eredmények
Az egészséges kontrollokhoz képest a rohammentes állapotban lévő HANO-s betegeknek szignifikánsan alacsonyabb fetuin-A és TNFα (TNFSF2) koncentrációjuk volt (11.2.1.
ábra). A CRP és a D-dimer szintje nem különbözött jelentősen a két csoport között.
11.2.1. ábra. Egészséges személyek és herediter angioneurotikus ödémás betegek szérum fetuin-A, CRP, TNFα és D-dimer koncentrációja. Medián és kvartilis értékek. Az összehasonlítás Mann-Whitney teszttel történt. CRP: C-reaktív protein; TNFα: tumor nekrózis faktor-α (TNFSF2)
A rohamok alatt a fetuin-A szint jelentősen emelkedett a rohammentes állapothoz képest (11.2.2. ábra). Ezzel ellentétben a roham alatt és a rohammentes periódusban mért CRP és TNFα (TNFSF2) koncentráció nem különbözött lényegesen egymástól. A D-dimer szint szignifikánsan emelkedett a roham alatt a rohammentes periódushoz képest és magasabb volt, mint az egészséges kontrollokban (p < 0,006). A thromboemboliás betegségekben az általánosan elfogadott 0,5 µg/ml-es határértékkel szemben az általunk használt Diagon kit a 0,7 µg/ml-es értékkel harmonizál legjobban [492], ezért a rohammentes időszakban kapott érték negatívnak tartható.
11.2.2. ábra. Herediter angioneurotikus ödémás betegek rohammentes időszakban és roham alatt mért szérum fetuin-A, CRP, TNFα és D-dimer koncentrációja. Medián és kvartilis értékek.
Az összehasonlítás Wilcoxon-teszttel történt. TM: rohammentes időszak; R: roham alatt; CRP: C-reaktív protein; TNFα: tumor nekrózis faktor-α (TNFSF2)
A rohammentes periódusban a szérum fetuinA szint nem korrelált sem a CRPvel (r = -0,111, p = 0,598), sem a TNFα-val (TNFSF2) (r = 0,021, p = 0,939), sem a D-dimerrel (r = 0,327, p = 0,172), sem azok egymással. Roham alatt a fetuin-A szintén nem korrelált sem a CRP-vel (r = 0,189, p = 0,377), sem a TNFα-val (TNFSF2) (r = -0,134, p = 0,634), de a D-dimer szinttel sem (r = -0,314, p = 0,177). A tartós profilaxist kapó és az abban nem részesülő betegek fetuin-A szintje sem különbözött szignifikánsan egymástól.
A betegeket a roham lokalizációja szerint is csoportosítottuk (11.2.2. táblázat). A szérum fetuin-A koncentráció a subcutan ödémás roham esetében jelentősen emelkedett a rohammentes periódushoz képest. Submucosus roham esetén is észleltük a különbséget roham alatti és a nyugalmi időszak értéke között, de a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns.
11.2.2. táblázat. A szérum fetuin-A, CRP és TNFα (TNFSF2) koncentrációja a rohamok lokalizációja szerint herediter angioneurotikus ödémás betegekben
Rohammentes periódus Roham alatt p# Subcutan roham (n = 12)
Fetuin-A (mg/l) 254 (200-273) 295 (260-325) 0,033
CRP (mg/l) 1,19 (0,99-6,16) 3,61 (0,79-4,44) 0,722
TNFα (ng/ml) 2,19 (1,70-2,83) 2,73 (1,75-3,71) 0,237 D-dimer, (µg/ml) 0,52 (0,22-0,74) 1,15 (0,41-4,47) 0,110
Submucosus roham (n = 12)
Fetuin-A (mg/l) 265 (241-297) 286 (262-320) 0,308
CRP (mg/l) 1,84 (0,71-4,41) 3,64 (1,34-5,66) 0,272
TNFα (ng/ml) 2,58 (1,11-2,88) 3,17 (1,80-4,75) 0,310 D-dimer, (µg/ml) 0,72 (0,17-2,19) 2,44 (1,07-16,52) 0,116 Medián (25-75 percentilis) értékek. Az összehasonlítás Wilcoxon-teszttel történt. CRP: C-reaktív protein; TNFα: tumor nekrózis faktor-α (TNFSF2)
11.2.3. Megbeszélés
A fetuin-A koncentrációt HANO-ban még nem vizsgálták. A rohammentes HANO-s betegekben talált, az egészséges kontrollokhoz képest csökkent szérum fetuin-A koncentráció nem magyarázható a molekula negatív akut fázis tulajdonságával [84, 90], mert a CRP és a TNFα (TNFSF2) nem emelkedett ennek megfelelően. A betegeknek nem volt dokumentált fertőzésük a roham alatt. Mivel a fetuin-A koncentráció egyik betegcsoportban sem korrelált sem a CRP, sem a TNFα (TNFSF2) szinttel, az egészségesekhez képest talált csökkenés mechanizmusa valószínűleg független az akut fázis reakciótól.
A tünetmentes betegek TNFα (TNFSF2) koncentrációja is az egészséges kontrollok alatt volt. Mások (Demitürk és mtsai) [493] és a Semmelweis Egyetem Angioödéma Központ munkatársai (Veszeli és Farkas) is ezt találták korábban egy másik betegcsoportban [494].
Demitürk csak az I-es típusú HANO-ban észlelte, a II-es típusban nem.
A TNFα (TNFSF2) szintet a danazol kezelés is csökkenthette, ahogy ezt endometriosis kezelése során megfigyelték [495], de a HANO danazol kezelése során ezt még nem vizsgálták.
A szérum fetuin-A koncentráció meglepő módon szignifikánsan emelkedett a HANO-s rohamok alatt, különösképpen a subcutan formában. A roham alatti fetuin-A emelkedés elvileg lehetne a hemokoncentráció hatása is, azonban ennek ellene szól, hogy a vizsgált többi paraméter (CRP, TNFα) koncentrációja nem emelkedett a roham alatt.
Számos megfigyelés szól ugyanakkor a fetuin-A gyulladáscsökkentő szerepe mellett. A molekula neutrofil granulocitákban gátolja a szuperoxid gyökök felszabadulását [496], deaktiválja a makrofágokat [262]. Nélkülözhetetlen a spermin TNFα (TNFSF2) felszabadulást gátló hatásának létrejöttéhez [94] és direkt módon gátolja a kórokozó-kapcsolt molekuláris mintázat (pathogen-associated molecular pattern, PAMP)-indukálta high mobility group box 1 (HMGB1) felszabadulást az elsődleges immunválasz során [93].
Emellett a fibrózis kialakulásában központi szerepet játszó TGFβ antagonistája [27] és segíti a sebgyógyulást [497].
A fetuin-A erőteljesen és specifikusan gátolja a karragén (tengeri hínárból előállított, lineáris kéntartalmú poliszacharid-család) indukálta TNFα (TNFSF2) felszabadulást és ödémaképződést patkányban [263]. Szintén patkányban az exogén fetuin-A adása védő hatásúnak bizonyult kísérletesen előidézett cerebrális ischaemiában [97]. A védő hatás a helyi TNFα (TNFSF2) termelés gátlásában, az infarcerált terület méretének és az ödémás terület csökkenésében nyilvánult meg.
Emellett az ischaemiás szövetekből és szeptikus sokkban felszabaduló késői proinflammatorikus citokin, a HMGB1 2-3-szorosára emeli a fetuin-A koncentrációt [498].
A TNFα-val (TNFSF2) és az IL-1β-val együtt a HMGB1 szintén fokozza az érpermeabilitást [499]. A fetuin-A szint emelkedés biológiai jelentősége ezáltal az érpermeabilitás csökkentése, az ödémaképződés gátlása, a gyulladás késői fázisának csökkentése, az endothel barrier funkciójának megőrzése.
Az angioödémás roham alatt észlelt fetuin-A szint emelkedés másik magyarázata a kinin-bradykinin rendszer aktiválódása lehet. Az utóbbi években érdekes közlések láttak napvilágot, melyek a bradykinin rendszer és a fetuin-A kapcsolatára utalnak. Az 1-es típusú bradykinin receptor (BR1) a gyulladás által indukált receptor. A BR1-re knock-out egerek fetuin-A koncentrációja csökkent a vad típusúakhoz képest [500]. Ezen túlmenően, ezeknek az egereknek – a fetuin-A hiányára jellemzően – csökkent inzulinrezisztenciájuk van és védettek a magas zsírtartalmú étrend indukálta zsírmájjal szemben is [308]. Így nem kizárt, hogy a BR1 receptor aktiválódása a fetuin-A szintézis fokozódásával jár együtt.
A vizsgált HANO-s betegek CRP szintje nem változott lényegesen, sem a kontrollokhoz viszonyítva, sem pedig a rohamok előtt vagy alatt. Ez egybehangzik Oshawa megfigyeléseivel, aki a leukocitózis ellenére normális CRP szintet talált, még hasi roham esetén is [501].
Mások viszont a betegek 20%-ában még rohammentes periódusban emelkedett CRP szintet mértek, mely a következő 24 órában tovább nőtt, főleg, ha a betegnek hasi rohama volt [502]. A jelenséget az állandóan jelen lévő szubklinikus gyulladással és rohamok alatt a bakteriális LPS transzlokáció stimuláló hatásával magyarázták [502]. A CRP koncentráció eltérésnek a mintavétel eltérő időzítése is oka lehet. Hofmann vizsgálataiban a CRP emelkedése a roham elején (az első 5–24 órában) volt észlelhető, szemben a 7. és 22. napon mért értékekkel. Ezzel egybehangzóan Veszeli és mtsai egy másik betegcsoportban (n = 26) a CRP-t emelkedettnek találták a rohammentes időszakban is, mely a roham alatt, a neutrofil aktiváció során tovább nőtt [494]. Ez némileg ellentmond a mi eredményeinknek, mivel a rohamos vérmintákat az első 6 órában vettük le. Az esetkontrollos felépítés és kis esetszám a vizsgálataink korlátja. Az irodalmi adatokkal egybehangzóan a rohamok alatt a D-dimer szint emelkedett [503-505].
Összefoglalva, a szérum fetuin-A koncentráció vizsgálatának nincs diagnosztikus értéke HANO-ban, de a subcutan roham alatt tapasztalható emelkedés védő szerepre utal. A szérumkoncentráció emelkedésének oka az endothelium károsodás által kiváltott fokozott szintézis lehet, mely a barrier funkciót védi.