3. A rekombináns humán fetuin-A-val végzett vizsgálatok
3.1. A rekombináns humán fetuin-A előállítása és poszttranszlációs modifikációjának
3.1.1. Módszerek
3.1.1.1. A fetuin-A cDNS klón izolálása
Normál humán májból λ11 fág segítségével konstruált cDNS könyvtárat anti-fetuin-A-val (Behringwerke Marburg, Németország) pásztáztunk (screeneltünk).
A könyvtár pásztázása során korábban 50 000 cDNS bakteriális plakkot átvizsgálva 5 olyan klónt találtunk, melyek konzekvensen reagáltak az antiszérummal. Ezekből egy 1,2 kb hosszú cDNS-t sikerült izolálnunk, mely nem tartalmazta a bevezető szekvenciát és az első 99 aminosavat. Ezért egy másik cDNS könyvtárat vizsgáltunk végig ezzel a részleges inzerttel. Sikerült a teljes kódoló szekvenciát tartalmazó, kb. 1,5 kb hosszúságú cDNS-t izolálnunk. Ezt a cDNS-t a p-Bluescript KS (-) plazmidba (Stratagene, La Jolla, CA, USA) klónoztuk és teljes hosszában szekvenáltuk [136]. A cDNS két szálának dideoxi szekvenálása azt mutatta, hogy a fehérje teljes hosszúságában megvolt, a bevezető peptiddel együtt. Az általunk talált szekvencia az ATG kodontól 4 bázissal följebb kezdődött és teljesen megegyezett a korábban leírtakkal, azzal a különbséggel, hogy a 419.
helyen A helyett C nukleotidot találtunk, mely a 106. aminosav helyen lizin helyett treonint kódolt. Ez valószínűleg egy fetuin-A allél variánsnak felelt meg.
3.1.1.2 A rekombináns bakulovírus transzfer vektor (pVL1392-fetuin-A) előállítása A fetuin-A inzertet EcoRV és BalI restrikciós enzimmel kivágtuk p-Bluescriptból és a pVL1392 transzfer plazmid (In Vitrogen, San Diego, CA, USA) SmaI helyére klónoztuk, blunt-end kötéssel. A kapcsolódások szekvenciája a vártnak megfelelő volt. Az inzert orientációjáról a megfelelő restrikciós emésztéssel nyert szakaszok hosszúságának analízisével győződtünk meg.
3.1.1.3. A rekombináns vírus előállítása
Az Sf9 Spodoptera Frugiperda rovarsejtvonalat (In Vitrogen) 10% fötális borjúszérumot (FCS) tartalmazó 27°C hőmérsékletű Grace mediumban szuszpendáltuk palackonként 3*106 sűrűségben. Két µg PVL1392-fetuin-A DNS-t transzfektáltunk 1 µg Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Vírussal (ACMNPV, In Vitrogen). A sejteket 5 napig 10% FCS-ban inkubáltuk, majd a rekombinánsokat dot-blottal (BioRad, Richmond, USA) azonosítottuk. Az azonosításhoz random priming módszerrel jelölt fetuin-A cDNS-t
használtunk (Stratagene, La Jolla, CA, USA) [137]. A pozitív sejteket limitált hígítással egy darab rekombináns vírus szintjéig tisztítottuk. A végső izolátum 10-7-ig terjedő hígításban pozitív volt.
3.1.1.4. A rekombináns humán fetuin-A termeltetése rovarsejtekben és a fehérje izolálása
A bakulovírust 2,5 ml térfogatban (plakk assay-vel meghatározott titere: 9*108 pfu/ml) adtuk 106 Sf9 sejthez T75 sejtkultúra edényben (teljes térfogat: 32,5 ml). A vad és a rekombináns vírussal fertőzött sejteket 27 C-on FCS-t nem tartalmazó Grace médiumban tároltuk. Előzetes kísérleteink alapján a fehérje termelésének optimuma a 7. napra esett, ezért ekkor gyűjtöttük le a felülúszót, majd 200 pM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) adtunk a sejtekhez.
3.1.1.5. Egyéb sejtkultúrák
A Hep3B sejtvonal az American Type Culture Collectiontól származott és 10% FCS-t tartalmazó Dulbecco módosított Eagle médiumban tartottuk. A sejteket FCS-mentes médiumban inkubáltuk és szintén FCS-t nem tartalmazó médiumban voltak 5 napig, majd legyűjtöttük a felülúszót.
3.1.1.6. Antitestek
Fetuin-A ellenes antitestek. A fetuin-A ellenes antitesteket először dr. Baudnertől (Behringwerke, Marburg, Németország) kaptuk. A további kísérletekhez a tisztított fetuin-A 200 mg mennyiségével nyulakat immunizáltunk. fetuin-Az első oltást 100 mg-os booster adag követte a 3., a 4. és az 5. héten. Az antitestet normál humán szérum és tisztított fetuin-A ellenében vizsgáltuk.
A nyulakat az első oltást követő 12. héten véreztettük el. Kettős immundiffúzióval, immunelektroforézissel és Western blottal vizsgálva az antiszérum nem mutatott keresztreakciót semmilyen humán vagy rovarfehérjével. Az antiszérumot immobilizált Protein-A-t tartalmazó oszlopon affinitás-kromatográfiával tisztítottuk, és 1:1000 hígításban a Western blothoz használtuk.
Az összekötő peptid elleni antitestek. A B lánc utolsó 10 (azaz az egyláncú fehérje 340.–
349. aminosava) ellen termelt antitest Dr. W. Jahnen-Dechent ajándéka volt. Ezzel az antitesttel a redukáló körülmények között futtatott immunblotokon különbséget tudtunk
tenni az egy- és a kétláncú fetuin-A között. Az összekötő peptid ellenes antitestet 1:1000 hígításban a Western blothoz használtuk.
3.1.1.7. Metabolikus jelzés és immunprecipitáció
A 32P izotóppal történő jelölést a Jahnen-Dechent és mtsai által leírt módon végeztük [138].
A sejteket foszformentes médiumban mostuk, és kb. 300 µCi 32P-ortofoszforsavat adtunk a 10 cm átmérőjű Petri csészében lévő 106 sejthez. Négy órán át tartó 37 C-os inkubációt követően a felülúszót 2500/perc fordulatszámon lecentrifugáltuk és 20 µl fetuin-A-ellenes szérumot adtunk hozzá. A csöveket 4°C-on 1 órán át folyamatosan rázva 50 µl protein A-agarózt (Pierce, Rockford, IL, USA) adtunk hozzájuk, majd 4 C-on 1 órán át inkubáltuk.
Az agarózt a fenti paraméterekkel történt centrifugálással távolítottuk el, majd 3-szor Tnet pufferben mostuk [138]. Utána 100 µl SDS mintapuffert (mely 2-merkaptoetanolt tartalmazott) adtunk mindegyik galacsinhoz, és 10 perces forralás után 25 µl-nyi mennyiségeket SDS gélen futtattunk (10% folyamatos gél). A géleket Whatman 3MM szűrőpapíron szárítottuk és XOMAT-AR filmre exponáltuk (Kodak, Scientific Imaging Films) -70°C-on éjszakára.
3.1.2. Eredmények
A fetuin-A izoelektromos képét az 3.1.1. ábra mutatja.
3.1.1. ábra. A különböző eredetű fetuin-A molekulák izoelektromos fókuszálásos képe. A gél pH grádiense 3,5–8 között volt. A futtatás és az immunblot körülményeit Boutin és mtsai leírása alapján állítottuk be [139]. Első antitest: nyúlban termelt anti-humán fetuin-A 1:1000 hígításban.
Második antitest: peroxidázzal jelzett, kecskében termelt anti-nyúl antiszérum (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). A katód felül van. 1. oszlop: Hep3B sejt felülúszó, 2. oszlop: HepG2 sejt
felülúszó, 3. oszlop: normál humán szérumból tisztított fetuin-A, 4. oszlop: rovarsejtek felülúszója, 5. oszlop: rekombináns fetuin-A, 6. oszlop: normál humán szérum.
A tisztítást követően a fetuin-A csíkok sorozatként mutatkoztak, melyek a normál humán szérumból származókhoz képest az anódhoz közelebb helyezkedtek el. Ezzel ellentétben a Hep3B sejtek felülúszójából származó fetuin-A a normál humán szérumhoz származóhoz képest is katodálisan helyezkedett el, és leginkább a rekombináns vírussal transzfektált Sf9 sejtek felülúszójából származó fetuin-A-hoz hasonlított.
A 3.1.2. ábra a rovarsejtek és a Hep3B sejtek felülúszójában lévő fetuin-A-t hasonlítja a normál humán szérumból származó molekulához az összekötő peptid jelenlétének szempontjából.
3.1.2. ábra. Az összekötő peptid jelenlétének vizsgálata a különböző eredetű fetuin-A molekulákban immunblottal. A mintákat 10%-os SDS-PAGE-n futtattuk, redukáló körülmények között. A futtatás befejeztével a fehérjéket nitrocellulóz membránra blottoltuk éjszakára. A membránokat Kellermann módszere szerint kezeltük [21], azzal a változtatással, hogy az első antitest a fetuin-A összekötő peptidje ellen irányuló antitest volt [138]). A színreakció labilitása miatt a blotot az előhívás után azonnal digitalizáltuk AppleColor Scannerben OfotoTM 1.1. szoftver alkalmazásával (Light Source Computer Images, Greenbrae, CA, USA). 1. sor: molekulatömeg markerek (Bio-Rad), 2. sor: normál humán szérum 1:100 hígítás, 5 µl, 3. sor: hígítatlan Hep3B felülúszó, 20 µl, 4. sor: a rekombináns bakulovírussal transzfektált sejtek hígítatlan felülúszója, 20 µl.
A membránokat az összekötő peptid-ellenes antiszérummal hibridizálva látszik, hogy a Hep3B és a rekombináns bakulovírussal transzfektált sejtek felülúszója reagál az antiszérummal, viszont a normál humán szérumból származó fetuin-A nem.
Amikor a sejteket 32P izotóppal jelöltük és a felülúszót specifikusan immunprecipitáltuk, mindkét májsejtvonal és a rovarsejtvonal is metabolikusan jelződött, mutatva, hogy a fetuin-A foszforilálódott ezekben a sejtekben (3.1.3. ábra).
3.1.3. ábra. A sejtfelülúszókban lévő 32P izotóppal jelzett fetuin-A autoradiográfiás képe. A Hep3B sejteket és a rovarsejteket 32P-vel jelölt ortofoszfátot adtunk 4 órán át. Az összes felülúszót immunprecipitáltuk fetuin-A- és Protein-A agaróz-ellenes specifikus antiszérummal. A precipitátumok izolálása után 100 µl, 2-merkaptoetanolt is tartalmazó SDS puffert adtunk hozzájuk, és 25 µl mintát 10%-os SDS gélen futtattuk. A futtatás után a gélt megszárítottuk és autoradiográfiás filmen exponáltuk. 1. oszlop: a vad típusú AcMNPV bakulovirussal transzfektált rovarsejtek felülúszója, 2. oszlop: Hep3B sejt felülúszó, 3. oszlop: a rekombináns bakulovírussal transzfektált rovarsejtek felülúszója.
A foszforilációt foszfoszerin-ellenes monoklonális antitesttel (Sigma, 1:200-as hígítás) is vizsgáltuk az immunprecipitátumokban. Csak a sejtkultúrákból származó precipitátumokkal kaptunk pozitivitást, a normál humán szérumból származó fetuin-A-val nem.
3.1.3. Megbeszélés
Elsőnek mutattunk rá a humán fetuin-A foszforiláltságának jelentőségére [140]. Az a felfedezés, miszerint a humán fetuin-A a patkányban lévő IRTK gátló tulajdonságú pp63 foszforilált fehérje homológja, fontos előrelépés volt a fetuin-A biológiai szerepének megértéséhez [35, 141].
Bár a humán és a patkány fehérje aminosav sorrendje csak 60%-ban azonos, a cisztein reziduumok száma és helyzete, a két cisztatin domén teljesen konzervált. Emellett a glikozilációs szekvenciák, a proteolitikus vágási, valamint a foszforilációs helyek is azonosak mindkét fehérjében [141].
Korábban azt találtuk, hogy a humán szérumból származó fetuin-A nem gátolta számottevően az IRTK aktivitást izolált inzulin receptorokon. A májsejtvonalak felülúszóiból származó fetuin-A szintén nem mutatott meggyőző gátló hatást. Ezt a fehérje törékenységével és tisztításának nehézségeivel magyaráztuk. Másoknak is volt hasonló megfigyelésük [141]. Ugyanakkor Srinivas és mtsai olyan fetuin-A frakciót izoláltak affinitáskromatográfiával, melynek volt IRTK gátló hatása [110]. Ezért mi olyan rekombináns bakulovírust állítottunk elő, mely rovarsejtekben termelte a fetuin-A-t. A rekombináns fehérje dózisfüggő módon gátolta a receptor autofoszforilációját, de nem gátolta meg az inzulinnak receptorához történő kötődését. Két hónapos -70°C-on való tárolás után a rekombináns fehérje aktivitása felére csökkent. Ez arra utalt, hogy a rekombináns fehérje megváltozott, szükségessé téve a rekombináns fehérje poszttranszlációs modifikációjának vizsgálatát.
A különböző eredetű fehérjék izoelektromos fókuszálással és immunfixációval történő vizsgálata azt mutatta, hogy a normál humán szérumból származó fetuin-A a katódhoz közelebb helyezkedett el a Hep3B és a rovarsejt eredetű fehérjéhez képest, bár mindegyikük jelentős kifejezett mikroheterogenitást mutatott. Ismert, hogy a fetuin-A mikroheterogenitását főleg a sziálsav-tartalom eltérése adja [135, 139], ezért valószínűleg nem a glikozilációs különbség felelős a pI-ben látható eltérésekért. Az összekötő peptid ellen termelt monospecifikus antitesttel kimutattuk, hogy mind a májsejtvonalakból, mind a rovarsejtekből származó natív fetuin-A-n van összekötő szakasz. Mivel a mintákat redukáló körülmények között futtattuk, a natív fetuin-A egy láncként volt jelen. A natív egyláncú fetuin-A kétláncúvá alakulását humán májsejtvonalon tanulmányozták [138]. A HepG2 és a Hep3B sejtvonal által termelt fetuin-A is egy láncból áll, de a felülúszóban mind az egyláncú, mind a kétláncú forma jelen van [138]. A rovarsejtek által termelt fetuin-A is egyláncú.
A következő lépésben a fetuin-A foszforilációját vizsgáltuk. A fetuin-A csak egy szerin helyen foszforilált [138]. A HepG2 sejtek teljes foszforilált fetuin-A-t termelnek [138]. Az immunprecipitációt és autoradiográfiát követő metabolikus jelzéssel kimutattuk, hogy a
bakulovírus expressziós rendszerben termelt rekombináns humán fetuin-A is foszforilált.
A foszforiláció mértéke a májsejtvonalakban találtakkal azonos mértékű volt. A foszfoszerin-ellenes monoklonális antitesttel vizsgálva a normál humán szérumból származó fetuin-A nem tartalmazott foszfoszerint (a mi mérési tartományunkon belül).
Vizsgálataink gyakorlati jelentősége a következő: Mivel a rekombináns fetuin-A hatékonyan gátolja az IRTK-t, miközben a szérumból származó molekula vagy hatástalan [141], vagy legalábbis 100-szor kevésbé hatásos [142], arra utal, hogy a molekula szekrécióját követően kialakuló szerkezeti változásoknak nagy jelentőségük az IRTK aktivitás gyors gátlásának a szérumban. Eredményeink arra utalnak, hogy ez a gátlási folyamat az összekötő peptid defoszforilációján és/vagy hasításán keresztül valósulhat meg. Megfigyelésünket nemrégen állatkísérletben és humán vizsgálatban igazolták: a fetuin-A foszforilált formája az, amelyik aktívan gátolja az inzulin hatását és mutat összefüggést az elhízással és az inzulin rezisztenciával [143].