Non-ribosomal peptide synthetases

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Engineering and characterisation of non-ribosomal peptide synthetases

Engineering and characterisation of non-ribosomal peptide synthetases

Die erste Publikation im Zuge dieser Arbeit, welche unter dem Titel „De novo design and engineering of non- ribosomal peptide synthetases“ veröffentlicht wurde, befasst sich mit der Entwicklung eines solchen Leitfadens. Hierzu wurden drei Regeln formuliert: Erstens wird eine A-T-C-Tridomäne anstelle eines Moduls als katalytische Einheit betrachtet und als Exchange Unit (XU) bezeichnet. Die XUs werden als Bausteine für die Modifizierung und Neuorganisation von NRPSs verwendet. Da innerhalb einer XU nicht nur die A-Domäne auf ihr Substrat eine Spezifität, sondern auch die C-Domäne auf die eingebaute Aminosäure der nachfolgenden XU besitzt, muss als zweite Regel diese Spezifität einer XU berücksichtigt werden. Drittens definiert ein konserviertes WNATE-Motiv innerhalb des Linkers, welcher die C- und A-Domäne verbindet, den Fusionspunkt zwischen den XUs.
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Unusual Building Blocks and Domain Organization of Non-Ribosomal Peptide Synthetases

Unusual Building Blocks and Domain Organization of Non-Ribosomal Peptide Synthetases

Natural  products  from  traditional  microbial  sources  have  played  an  important  role  as  valuable  antibiotics  and  other  drugs  but  interest  in  them  waned  in  the  1990s  when  major  pharmaceutical  companies  decided  that  their  discovery  was  no  longer  cost‐ effective  and  instead  concentrated  on  synthetic  chemistry  as  a  source  of  novel  compounds. 23   With  the  development  of  molecular  genetic  methods  to  isolate  and  manipulate the complex microbial enzymes that produce natural products, unexpected  chemistry  has  been  revealed  and  interest  in  the  compounds  has  again  flowered. 13   An  excellent  example  is  the  success  story  of  the  clinically  approved  daptomycin,  which  is  produced  by  S.  roseosposrus  and  is  used  for  the  treatment  of  skin  infections  and  bacteremia  caused  by  multi‐drug  resistant  bacteria,  including  MRSA  and  VRE. 176   Daptomycin  belongs  to  a  new  class  of  potent  antibiotics.  Members  are  beside  the  aforementioned  daptomycin, 178   the  complex  A54145, 182   produced  by  S.  fradiae,  the  calcium‐dependent  antibiotics  (CDA), 170   produced  by  S.  coelicolor  and  other  actinomycete‐produced  antibiotics.  The  acidic  lipopeptides  contain  various  non‐ proteinogenic  amino  acids,  which  are  often  highly  functionalized  by  the  action  of  modifying  or  so  called  tailoring  enzymes. 15,16   Little  was  known  about  the  origin  of  the  non‐proteinogenic  amino  acids  as  well  as  the  mechanisms  underlying  their  generation  when  this  study  was  initialized. 176   Furthermore  the  mode  of  action  of  these  tailoring  enzymes was not clear, as they could either functionalize an amino acid prior to, during  or after the nonribosomal assembly of the antibiotic. 185  
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Bacillus subtilis as heterologous host for the secretory production of the non-ribosomal cyclodepsipeptide enniatin

Bacillus subtilis as heterologous host for the secretory production of the non-ribosomal cyclodepsipeptide enniatin

This contribution reports on a cellular system for heterologous expression of a fungal, non-ribosomally synthesized peptide based on the Gram-positive bacterium B. subtilis. To assess the suitability of this expression host for heterologous NRPS expression, the non-ribosomal peptide synthetase-encoding gene esyn from the fungus F. oxysporum was used. This choice was based on the natural capacity of B. subtilis for the overproduction of the non-ribosomally synthesized lipopeptides surfactin and plipastatin or the PKS/NRPS- hybrid molecule bacillaene. As shown by the results of this study, in B. subtilis, enniatin is actively exported, probably using a native secondary metabolite transporter system, whereas esyn expression in the Gram-negative expression host E. coli leads to an exclusive intracellular accumulation of enniatin (data not shown). Similar intracellular accumulation of metabolites was observed in previous studies on heterolo- gous expression in E. coli regarding the homologous cyclooligomer depsipeptide synthetases, e.g. beauvericin syn- thetase of Beauveria bassiana (Matthes et al. 2012 ) or valinomycin synthetase produced by Streptomyces tsusimaensis (Jaitzig et al. 2013 ).
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Activity and substrate specificity of bacterial and human ribosomal oxygenases

Activity and substrate specificity of bacterial and human ribosomal oxygenases

Generation of OGFOD1 knockout cell lines in Hek293 cells was not possible, only one heterozygous knockout clone could be generated. In contrast, generation of MINA53 and NO66 knockouts in Hek293 cells was successful. Judging from protein levels of wild type and OGFOD1 D2 +/- cells, protein levels seemed even to be compensated by the remaining OGFOD1 gene copy. Considering the unchanged protein amount and a growth behaviour comparable to wild type cells, also the ribosomal profile of the heterozygous OGFOD1 D2 cells did not differ from wild type. Analysis of the ribosomes by MS confirmed the compensation of OGFOD1 protein levels, as the RPS23 P62 was only identified in the hydroxylated status in OGFOD1 D2 cells.
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Expanding the Scope of Orthogonal Translation with Pyrrolysyl-tRNA Synthetases Dedicated to Aromatic Amino Acids

Expanding the Scope of Orthogonal Translation with Pyrrolysyl-tRNA Synthetases Dedicated to Aromatic Amino Acids

2.1.1. MmPylRS Mutagenesis Strategy and Screening towards Tryptophan and Tyrosine Analogs Initial MmPylRS gene libraries were constructed by mutating two key aaRS positions: N346 and C348 (Figure 2 ). Rational aaRS design aimed to provide specific enzyme–substrate interactions that enable binding and activation of the corresponding ncAAs. Accordingly, active site residue N346 was mutated to A, G, and S, whereas C348 was mutated to Q, N, and M. In previous studies, the structures of two PylRS variants (N346G/C348Q and N346S/C348Q) were modeled, which revealed crucial interactions between these aaRS side chains and substrates in the form of aromatic amino acids [ 18 , 24 , 25 , 27 , 28 ]. Due to the increased bulkiness of the ncAA analogs, enlarging the enzyme binding pocket may improve the access and recognition of the aromatic moieties, allowing charging onto tRNA Pyl and ribosomal incorporation. Next, based on the PylRS structure and activity data collected from a large number of enzyme mutants, residues V401 and W417 (Figure 2 ) were targeted. These were expected to define ncAA specificity towards hydrophobic or polar amino acids [ 10 , 29 ]. Moreover, positions L305, Y306, and L309 shape the aaRS active site pocket. These five positions (L305, Y306, L309, V401, and W417) were chosen for full randomization as they have direct influence on enzyme activity (Figure 2 ). The PylRS Y384F mutation, which conferred an increased aminoacylation rate in previous studies, was introduced into the starting PylRS sequence and remained fixed in all mutants [ 18 , 20 ]. Novel and semi-rationally designed MmPylRS gene libraries capable of activating aromatic ncAAs were successfully constructed. To detect the ribosomal incorporation of the chosen Trp and Tyr analogs, a reporter construct of super–folder green fluorescent protein (sfGFP) was used. The sfGFP gene contained an in-frame amber stop codon at the position downstream of the first methionine encoding codon (sfGFP–R2TAG) and a C-terminal His-tag. In this way, the sfGFP fluorescence signal of intact cells can be used as readout for the in vivo suppression of the in-frame amber stop codon, with fluorescence intensity and full-length protein yields proportional to suppression efficiency [ 23 ].
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Solid Phase Peptide Synthesis by Four Component Condensation: Peptide Formation on an Isocyano Polymer Support 

Solid Phase Peptide Synthesis by Four Component Condensation: Peptide Formation on an Isocyano Polymer Support 

Coupling of various protected amino acids or small peptides on an isocyano polymer and in the presence of 1 -methyl-3-formylindole dem- onstrates the feasibility of peptide formation b[r]

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A structural view on ligands at the ribosomal tunnel exit

A structural view on ligands at the ribosomal tunnel exit

The  data  presented  in  this  study  suggest,  that  the  interaction  between  RAC  and  the   80S ribosome is facilitated to a large extent by the newly described C‐terminal head domain  of Zuotin. This function was, however, previously attributed to the charged region of Zuotin.  Deletion  of  the  charged  region  has  been  shown  to  impair  Zuotin’s  ability  to  bind  to  ribosomes 116 .  Also,  short  peptide  fragments  of  this  region  were  found  to  interact  with  ribosomes 21 . In contrast, the results of this study demonstrate, that the exclusive deletion of  the  head  domain  has  the  same  impairing  effect  on  Zuotin’s  ribosome  interaction  as  a  combined  deletion  with  the  charged  region.  This  contradiction  may  be  explained  by  the  finding  that  the  charged  region  and  the  head  domain  partially  overlap.  The  common  sequence  (residues  349  –  364  in  S.  cerevisiae  or  residues  355  –  370  in  C.  thermophilum)  forms  the  α1  helix  of  the  head  domain  (Figure  28A).  This  α‐helix  is,  therefore,  likely  to  be  crucial  for  the  interaction.  Alternatively,  deletion  of  the  charged  region  could  inhibit  the  efficient binding of Zuotin to the 80S ribosome simply by decreasing the distance between  the  head  domain  and  Zuotin’s  second  binding  interface  (C2),  thereby  preventing  their  simultaneous interaction. In agreement with the data presented here, the existence of such  secondary  binding  interfaces  was  previously  suggested 21 .  This  would  also  explain  why  a  Zuotin mutant lacking only part of its charged region was found to be unable to interact with  ribosomes 21 .  
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Paradoxical natriuretic peptide resetting in astronauts

Paradoxical natriuretic peptide resetting in astronauts

Human studies in space provide unique and often unexpected findings regarding the role of terrestrial gravity for human cardiovascular and renal regulation. While vascular volume is shifted towards the head, which would be expected to increase natriuretic peptide (NP) release, preliminary observations suggested the opposite. Therefore, we assessed natriuretic peptide regulation on different controlled sodium diets in space and on Earth.

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New perspectives in oral peptide delivery

New perspectives in oral peptide delivery

There are many challenges to overcome when dealing with the oral delivery of peptides. The development of orally delivered peptides to replace injections remains a challenge, which would not only help improve the lives of patients, but also reduce healthcare costs worldwide. Orally delivered insulin is an ex- ample of this ultimate objective, providing undisputed thera- peutic advantages for non-invasive chronic use. However, the improvement of life quality and the safety of patients must be the driving force of oral delivery peptide research. The solution to such a complex problem requires approaches from various disciplines, with formulation and chemical modification being vital.
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Mesoporöse Silikananopartikel als Trägermaterial für therapeutische Peptide

Mesoporöse Silikananopartikel als Trägermaterial für therapeutische Peptide

verwendet wurden, um im Bereich der biokompatiblen Partikelkonzentrationen zu bleiben. Nach 24 h zeigt sich eine leichte Reduktion der Infektion um ~ 20%. Der Unterschied zum freien VIR576 ist allerdings noch sehr groß. Nach 48 h zeigen die peptidbeladenen MSN200c die gleiche Inhibierung der Infektion wie die freie Peptidlösung. Die Kontrolle der unbeladenen MSN200c zeigt für die ersten zwei Zeitpunkte keine Inhibierung der Infektion und für den 48 h Zeitpunkt eine sehr leichte Inhibierung. Dieses Experiment zeigt, dass die Funktionalität des von den MSN200c freigesetzten VIR-576 erhalten bleibt und nach ausreichend langen Zeiträumen genug freies Peptid vorhanden ist, um die Infektion der Zellen zu inhibieren. Das zeigt, dass mesoporöse Silikananopartikel als Trägermaterial für antivirale Peptide prinzipiell für die Therapie von HIV-Infektionen anwendbar sind. Produktiv infizierte Zellen haben im Durchschnitt eine Lebensdauer von 2,2 Tagen (Halbwertszeit t1/2 = 1,6 Tage) und Plasmavirionen eine mittlere Lebensdauer von 0,3 Tagen (t1/2 = 0,24 Tage). Die geschätzte durchschnittliche HIV-1- Gesamtproduktion liegt bei 10,3 × 10 9 Virionen pro Tag. Die Ergebnisse dieser Studie
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publish.UP Entwicklung influenzabindender Peptide für die Biosensorik

publish.UP Entwicklung influenzabindender Peptide für die Biosensorik

Es existieren auch Beispiele für Peptide, die ganze Zellen in biosensorischen Systemen detektieren können und dazu mit verschiedensten Signalgebungsmethoden verknüpft wurden. So werden antimikrobielle Peptide zum Nachweis von Bakterien mittels Leitfähigkeitsmessungen genutzt 62 . Ebenso wurde der Einsatz von 12-meren Peptiden zum simultanen Nachweis verschiedener Salmonellen durch mechanische Auslenkung mehrerer parallel angeordneter Mikrocantilever beschrieben 63 . Klassisch wurden Salmonellen und Escherichia Coli nach Bindung an spezifische Peptide auch mittels vorheriger Fluoreszenzmarkierung nachgewiesen 64 . Prinzipiell können Peptide analog klassischer Rezeptormoleküle (z.B. Antikörper) also mit verschiedensten Signalgebungsmethoden kombiniert werden. Zusätzlich eröffnen sie aufgrund ihrer geringen Größe die Möglichkeit der Generierung vollständig integrierter Biosensoren, welche die molekulare Erkennung (durch das Peptid) und die Signalgebung innerhalb eines Makromoleküls (sog. Sensor-Aktor- Moleküle) vereinen. Damit ermöglichen sie einen Nachweis ohne Probenaufbereitung oder Hinzufügen weiterer Reagenzien 65 .
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Overcoming Species Boundaries in Peptide Identification with Bayesian Information Criterion-driven Error-tolerant Peptide Search (BICEPS)

Overcoming Species Boundaries in Peptide Identification with Bayesian Information Criterion-driven Error-tolerant Peptide Search (BICEPS)

BICEPS Performs Error-tolerant Searches without a De- crease in Accuracy—As shown in the peptide level analysis, the error-tolerant performance of BICEPS is excellent. In a con- trived experiment (designed to offer ground truth), we find that the performance of BICEPS compares well to standard data- base search algorithms such as Mascot, ProteinPilot, or Se- quest even in cases when BICEPS has to overcome a large phylogenetic distance (here from chicken to human), whereas the standard approaches have the database of the species of interest available. The overlap between BICEPS results using a database of a distantly related species, and the results of stand- ard database search approaches against the appropriate target are similar to the overlap between the results from the various standard database search approaches. This means that there is no price to pay with regard to the quality of the peptide identi- fication results for an error-tolerant search with BICEPS. This even holds when BICEPS only has a database of a distantly related species compared with the appropriate target database, which may not be available. The results indicate that BICEPS also shows excellent performance for strongly modified se- quences with two substitutions.
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Phenylalanine Analogues: Potent Inhibitors of Phenylalanine Ammonia-Lyase Are Weak Inhibitors of Phenylalanine-tRNA Synthetases 

Phenylalanine Analogues: Potent Inhibitors of Phenylalanine Ammonia-Lyase Are Weak Inhibitors of Phenylalanine-tRNA Synthetases 

olism . S uch an an alogu e w ould th erefore be un­ suitable as an inhibitor o f a p henylalanin e m eta­ b olizin g en zym e in vivo. D u e to the discrim inating p ow er o f am in o a cy l-tR N A synthetases, on e may exp ect that few am ino acid an alogues will prove to be p ow erfu l in hibitors o f their resp ective acti­ vating en zym es, but the prudent use o f such inhibi­ tors in m etab olic stu d ies requires k now led ge o f their p ossib le in terferen ce with p rotein synthesis.

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Modulation der p53-Aktivität mittels zellpermeabler Peptide

Modulation der p53-Aktivität mittels zellpermeabler Peptide

Nach Renaturierung der Peptide in einem amingruppenfreien Puffersystem (s. Material und Methoden) wurden die Peptide unter Lichtabschluß bei Raumtemperatur mit einer verdünnten NHS–Fluorescein–Lösung entsprechend den Angaben des Herstellers inkubiert. Das nichtkonjugierte Fluorescein wurde durch Dialyse über Nacht aus der Lösung entfernt. Die so markierten Peptide wurden analog zu den Lyse–Internalisationsversuchen in einer Endkonzentration von 2 !Molar in den Überstand der auf Objektträgern kultivierten Zellen gegeben, 20 Minuten inkubiert und die Zellen anschließend drei Mal mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in eiskaltem, 100%–igem Ethanol fixiert und fluoreszenzmikroskopisch unter Anregung mit kurzwelligem Licht (!=488 nm) untersucht. Für alle drei Peptide zeigte sich bereits nach kurzer Inkubation eine Internalisierung (Abb. 22).
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Rolle der Relaxin-artigen Peptide in der Tumorbiologie der Schilddrüse

Rolle der Relaxin-artigen Peptide in der Tumorbiologie der Schilddrüse

beeinflusst sowohl die Zelldifferenzierung als auch das Zellwachstum in Mammatumoren der Ratte (Segaloff, 1983). Die Reaktion der humanen Brustkrebszellline MCF-7 auf Inkubationen mit Relaxin ist konzentrationsabhängig. Relaxin führt bei Konzentrationen zwischen 2x10 -10 M und 4x10 -10 M zur signifikanten Steigerung der Zellproliferation. Demgegenüber führen höhere Relaxinkonzentrationen zur Reduktion der Proliferation und zur Differenzierung in MCF-7 (Bigazzi et al., 1992). Bani und Mitarbeiter (Bani et al., 1994; Sacchi et al., 1994) beschrieben für hohe Relaxinkonzentrationen von 10 -9 M und 10 -10 M in MCF-7 eine Differenzierung mit Bildung duktaler Eithelverbände bei Kokultivierung mit humanen Myoepithelzellen. In Nacktmäusen resultiert die Behandlung mit 10 µg Schweinerelaxin pro Tag über einen Zeitraum von 19 Tagen in der Differenzierung eingebrachter MCF-7 Brustkrebszellen mit der Bildung Myoepithel- und Epithel- artiger Verbände (Bani et al., 1985, 1986, 1994). Anteile dieser Zellverbände bildeten vermehrt Zellkontakte und zeigten Veränderungen von Zellorganellen und Zytoskelett. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Relaxin die Differenzierung von Tumorzellen beeinflussen kann, und fordern uns, die zellulären Wirkmechanismen der beiden Relaxin-artigen Peptide zu untersuchen. Isolierte primäre humane endometriale Stromazellen und humane vaskuläre glatte Muskelzellen reagieren mit Proliferation auf die Inkubation mit rekombinantem humanem Relaxin (rhRlx). Relaxin (10 ng/ml) induziert nach 5 Minuten in diesen Zellen MAPK und MEK Proteine und führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB (Zhang et al., 2002). Dies zeigt einen für rhRlx einmaligen zellulären Signalweg, denn andere Moleküle der Insulin-artigen Hormone, wie Insulin oder IGF-1, führten nicht zur Aktivierung von CREB. Während der Fetalentwicklung induziert INSL3 die Proliferation der LGR8-exprimierenden Zellen des Gubernaculum testis und führt über das Wachstum des kaudalen Gubernaculumsegmentes zum Hodendeszensus. (Kumagai et al., 2002 ; Kubota et al., 2002). Informationen über einen mitogenen Effekt des INSL3 in Tumoren stehen zur Zeit nicht zur Verfügung.
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Rolle der Proteinkinase C bei der Wirkung antiarrhythmischer Peptide

Rolle der Proteinkinase C bei der Wirkung antiarrhythmischer Peptide

ischämie-induzierte Herzrhythmusstörungen (z.B. Herzkammerflimmern) verhindert werden, ohne das ein proarrhythmisches Risiko beobachtet wurde. Dieser Effekt beruht auf einer verbesserten Zellkopplung an den Gap Junctions. Dabei kommt es über die Phosphoinositolkaskade zu einer Aktivierung der Proteinkinase C (PKC), und somit zu einer vermehrten Phosphorylierung der Gap Junctions. Ziel dieser Arbeit war es mit Hilfe der Doppel-Zell-Voltage-Clamp-Technik den leitfähigkeitssteigernden Effekt eines Derivates der Antiarrhythmischen Peptide (das AAP10) zu messen, und durch isoformspezifische Hemmung der Proteinkinase C, und außerdem durch Blockierung des trans-Golgi- Apparates, weitere Erkenntnisse über den Signaltransduktionsweg des AAP10 zu erhalten. Die Messung der junctionalen Leitfähigkeit wurde an isolierten adulten Meerschweinchen- kardiomyozytenpaaren vorgenommen. Dazu wurde jede Zelle eines Zellpaares an einen Patch-Clamp-Verstärker angeschlossen, und an beiden Zellen die Whole-Cell-Konfiguration etabliert. Durch Anlegen einer Spannungsdifferenz zwischen den Zellen kommt es zum Stromfluß über den junctionalen Widerstand, der auf diese Weise gemessen werden konnte und Aufschluß über die junctionale Leitfähigkeit gab. In der Kontrollserie wurde die Wirkung des AAP10 auf die junctionale Leitfähigkeit gemessen. In den nachfolgenden Serien wurde durch intrazelluläre Gabe von HBDDE (blockiert die PKC α und die PKC γ ), und CGP54345 (blockiert die PKC α ) die PKC isoformspezifisch gehemmt. Außerdem wurde in einer weiteren Versuchsserie durch intrazelluläre Gabe von Monensin der Transport von Gap-Junction- Kanalbausteine (Connexine) vom Golgi-Apparat zur Membran blockiert. In der Kontrollserie konnte eine reversible signifikante Leitfähigkeitssteigerung unter AAP10 festgestellt werden, die durch HBDDE, CGP54345, und durch Monensin signifikant gehemmt wurde. Aus den Ergebnissen kann geschlußfolgert werden, daß AAP10 die Leitfähigkeit an den Gap Junctions über die PKC α steigert, und möglicherweise den Einbau von Connexinen in die Membran beschleunigt, und somit eine antiarrhythmische Wirkung am Herz bewirkt.
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Parodontitis als ein Risikofaktor für die Bildung von Antikörpern gegen citrullinierte Peptide

Parodontitis als ein Risikofaktor für die Bildung von Antikörpern gegen citrullinierte Peptide

Untersuchungen und speziellen Laborverfahren zur Bestimmung der bakteriellen DNA, der Humanen Leukozyten Antigene (HLA-Merkmale) und der citrullinierten Antikörper wurde beleuchtet, ob ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen PA bzw. parodontalen Leitkeimen und der Bildung von Autoantikörpern gegen citrullinierte Peptide besteht und welche weiteren Faktoren (Rauchen, Geschlecht, HLA-DRB1* Allele) hier eine Rolle spielen könnten. In vielen epidemiologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass unter Patienten mit PA die Prävalenz der RA über der der Normalbevölkerung lag [84, 110]. Klinische Parameter der PA innerhalb der RA-Gruppe sind signifikant mit Anti Citrullinated Peptide Antibodies (ACPAs) assoziiert im Vergleich zu Probanden ohne RA. ACPAs können bereits Jahre vor der eigentlichen Diagnose der RA bestimmt werden [51, 95].
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Darstellung und Charakterisierung cyclischer Peptide mit antimykobakterieller Aktivität

Darstellung und Charakterisierung cyclischer Peptide mit antimykobakterieller Aktivität

Derivate der ersten Gruppe (vgl. Kapitel 4.1) mit einer zusätzlichen D-Aminosäure, auch in Position V (Asn → D-Asn), übertrafen sogar die Wasserlöslichkeit der Leitsubstanz. Für die geringe Löslichkeit scheinen folglich die beiden Kriterien, Asn durch eine (1) aromatische Aminosäure in der (2) D-Konfiguration zu ersetzen, zusammen verantwortlich zu sein. Einen Fortschritt in der passiven Permeabilität wies in dieser Substanzgruppe lediglich 10c mit einer Permeabilität von 11 nm/s auf. Nach den von GSK gesetzten Richtwerten fällt die Substanz damit gerade in die Kategorie „mittelschnell permeierend“. Da es sich gleichzeitig um die lipophilste Substanz der Gruppe handelt und eine größere Lipophilie allgemein als Grundvoraussetzung für permeable Peptide genannt wird 137, 158-159 , wurde
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Die kardiale Freisetzung von Parathyroidhormon-related Peptide (PTHrP)

Die kardiale Freisetzung von Parathyroidhormon-related Peptide (PTHrP)

Der Subfamilie der Serotonin/Calcitonin-Rezeptoren gehören neben dem PTH1R noch zwei weitere für PTH bzw. PTHrP spezifische Rezeptoren an. Im Gegensatz zum PTH1R wird der von USDIN et al. 1995 identifizierte PTH2R nur in wenigen Geweben bzw. nur in bestimmten Zelltypen der jeweiligen Organe exprimiert. Die Gebiete höchster Expression befinden sich im Gehirn, eine geringere Ausprägung weisen die glatte Gefäßmuskulatur, die Herzmuskelzellen, die Endothelzellen des Herzens und arterieller Gefäße, der exokrine Pankreas und die Lunge auf. In seiner Aminosäuresequenz besitzt der Rezeptor eine 52%ige Homologie gegenüber dem PTH1R, wird jedoch von PTHrP nicht aktiviert (USDIN et al. 1997). Als einziger Ligand konnte zunächst PTH identifiziert werden. Der durch PTH induzierte, PTH2R vermittelte cAMP-Anstieg ist speziesspezifisch unterschiedlich ausgeprägt. So erreichte die cAMP-Konzentration in mit humanem PTH2R transfizierten COS7- Zellen nach Stimulation mit PTH einen dreifach höheren Wert als in Zellen, welche mit dem PTH2R der Ratte transfiziert waren (HOARE et al. 1999). Diese Beobach- tung und der Umstand, daß im Gehirn zwar eine hohe Expression an PTH2R-mRNA, aber keine (HOARE et al. 1999) oder nur geringe Mengen (HARVEY und FRASER 1993, USDIN et al. 1997) an PTH-mRNA gefunden werden konnten, ließ einen weite- ren, womöglich effektiveren Liganden für den PTH2R vermuten. Aus dem bovinen Hypothalamus konnte ein Protein isoliert werden, welches keine Aktivität am PTH1R besitzt und eine limitierte Homologie zu PTH und PTHrP aufweist (USDIN et al. 1999). Die Bindung dieses sogenannten ‚Tubuloinfundibular peptide of 39 residues‘ (TIP 39) an den PTH2R bewirkte bei der Ratte einen zweimal höheren Anstieg der cAMP-Konzentration in der Zelle als bei Stimulation des Rezeptors durch PTH. Aufgrund dessen ist TIP39 wahrscheinlich als primärer Ligand des PTH2R anzusehen (HOARE et al. 1999, USDIN et al. 2000).
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Selektion und Charakterisierung von Bindeproteinen
für amyloidogene Peptide und Proteine

Selektion und Charakterisierung von Bindeproteinen für amyloidogene Peptide und Proteine

Ein gemeinsames Merkmal praktisch aller neurodegenerativer Erkrankungen ist das Auftreten von Aggregaten fehlgefalteter Proteine beziehungsweise Peptide, der Amylo- id-Aggregate. Seit einigen Jahren verdichten sich die Hinweise darauf, dass kleine, lös- liche Vorläufer dieser Protein-Plaques in den betroffenen Hirnregionen Vorgänge auslösen können, die schließlich in der Degeneration der Nervenzellen resultieren. Die Charakte- risierung der nanoskaligen Protein-Oligomere wird allerdings durch die Komplexität der Aggregationsprozesse und durch die strukturelle Flexibilität der beteiligten Proteine stark erschwert. So ist der exakte Mechanismus der Amyloid-Neurotoxizität weiterhin unbe- kannt.
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