MALDI-TOF-Massenspektrometrie

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Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Polymeranalytik

Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Polymeranalytik

In der Regel ist die MALDI-TOF-Massenspektrometrie im Bereich der kleinen Molekulargewichte (< 10 4 g/mol) in der Lage, die genauen Massen der einzelnen Polymerketten innerhalb der Verteilung nachzuweisen. Dies gestattet eine direkte Charakterisierung der Wiederholungseinheit und der Endgruppen. Zusätzlich ermöglicht die Auswertung der Spektren in diesem Bereich sowie in dem höheren, unaufgelösten Bereich die Bestimmung der Molekulargewichtsmittelwerte M n und M w . Mehrere klassische Polymere wie Polystyrol, 18,19,20 Polyethylenglykol, 21,16,21,20 Polymethylmethacrylat 18,22,20 wurden mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie systematisch untersucht, und die daraus berechneten Molekulargewichte zeigen im Falle von engen Verteilungen eine gute Übereinstimmung mit den durch konventionelle Methoden erhaltenen Werte. 23 Wenn die Polydispersität einen Wert von ca. 1,2 erreicht, unterscheiden sich die mit MALDI und GPC gemessenen Molmassenmittelwerte jedoch um bis zu 20%. Bei breiteren Verteilungen liefern MALDI- Spektren unzuverlässige M n - und M w -Werte, die viel kleiner als die durch konventionelle Methoden erhaltenen Werte sind. 20 Für die Molekulargewichtsbestimmung einer breiten Polymerverteilung kann aber die MALDI-TOF-Massenspektrometrie trotzdem indirekt eingesetzt werden. Das MALDI-Gerät wird dann quasi als „off-line“-Detektor für die GPC genutzt. 24,25,26,27,28 Aus dem Eluat der chromatographischen Trennung werden Fraktionen gesammelt, deren Molmassenverteilung einen engen Schnitt der gesamten Probenverteilung darstellt. Von den so erhaltenen engen Molekulargewichtsverteilungen kann nun mittels MALDI-TOF eine genaue Molmassenbestimmung vorgenommen werden, die eine Kalibrierung der GPC-Kurven durch absolute Massen ermöglicht. Dadurch werden die Molekulargewichtsmittelwerte der Probe aus dem massenspektroskopisch kalibrierten GPC- Elugramm berechnet.
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Gutenberg Open Science: Untersuchungen zur Position der MALDI-TOF Massenspektrometrie in der Analytik von synthetischen Polymeren

Gutenberg Open Science: Untersuchungen zur Position der MALDI-TOF Massenspektrometrie in der Analytik von synthetischen Polymeren

Ein Vergleich der Verteilungen in Abbildung 62 macht deutlich, dass die beiden Methoden unterschiedliche Verhältnisse der Signalflächen liefern. Im Gegensatz zum HPLC-Chromatogramm nehmen die Signalflächen im MALDI-TOF Spektrum nicht monoton ab; außerdem ergibt sich die höchste Intensität für das Oligomer mit sieben Phenyleneinheiten (siehe Abbildung 63). Für beide Techniken stimmen die Steigungen in dem semilogarithmischen Diagramm ab einer Kettenlänge von circa 11 Phenyleneinheiten interessanterweise überein. Dies ist auch in etwa die Kettenlänge, bei der das Absorptionsspektrum mit dem des Polymers identisch wird (vergleiche Abbildung 58), und die daher auch als effektive Konjugationslänge bezeichnet wurde. Leider können aus dem Massenspektrum nur die Signalflächen der Oligomere bis zu 19 Phenyleneinheiten mit ausreichender Genauigkeit bestimmt werden, da die Signale der höheren Oligomere im Rauschen der Basislinie verschwinden. Aus den vorliegenden Daten ist die Frage, ob die Abhängigkeit der Signalfläche von der Kettenlänge in der HPLC und der MALDI-TOF Massenspektrometrie ab einer Größenordnung von 11 Phenyleneinheiten wirklich identisch wird, oder ob es sich lediglich um einen Zufall in einem beschränkten Massenbereich handelt, nicht zu beantworten.
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Erzeugung von Taq-DNA-Polymerasemutanten und Untersuchung ihrer Substratspezifität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Erzeugung von Taq-DNA-Polymerasemutanten und Untersuchung ihrer Substratspezifität mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Für die Hochdurchsatzanalyse der Substratspezifität von DNA wurde ein leistungsfähiges System unter Nutzung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie etabliert. Dazu wurden zunächst auf der Ba- sis eines bestehenden Expressionssystems 13 Varianten der Taq-Polymerase kloniert, bei denen die Aminosäuren Phenylalanin an Position 667 und Tyrosin an Position 671 in der O-Helix der Polyme- rasedomäne des Enzyms ausgetauscht wurden. An Position 667 wurde die Aminosäure Tyrosin ein- geführt (F667Y), an Position 671 jeweils die Aminosäuren Phenylalanin, Serin, Threonin, Trypto- phan, Histidin und Prolin. Alle Varianten an Position 671 wurden sowohl als Einzelmutationen als auch in Kombination mit F667Y kloniert. Die Enzymvarianten wurden nach einem Standardverfah- ren exprimiert und durch Metallchelat-Affinitätschromatographie isoliert. Vorläufige Aktivitätsun- tersuchungen durch den Einsatz in standardisierten PCRs ergaben, daß an Position 671 nur die Ein- führung von Phenylalanin (Y671F) ohne erkennbaren Aktivitätsverlust toleriert wurde. Gelelektro- phoretisch detektierbare PCR-Produkte konnten bei den übrigen Polymerasevarianten nicht nachge- wiesen werden. Daher wurde die spezifische Aktivität einer Auswahl der Polymerasevarianten durch einen nicht-radioaktiven Assay bestimmt. Die Aktivität der Einzelmutation F667Y lag bei 246 % des Wertes für die Enzymvariante TAQ mit der Wildtypsequenz in der O-Helix. Für die Ein- zelmutation Y671F und die Kombination Y671F/F667Y lag die spezifische Aktivität bei 14 % res- pektive 18 %.
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2'-Desoxy-7,9-dideaza-7-oxoadenosin : ein optimierteer Baustein für die MALDI-TOF Massenspektrometrie und biochemische DNA-Analytik

2'-Desoxy-7,9-dideaza-7-oxoadenosin : ein optimierteer Baustein für die MALDI-TOF Massenspektrometrie und biochemische DNA-Analytik

Die MALDI-TOF Massenspektrometrie stellt eine zukunftsweisende, schnelle, einfache und genaue Methode zur Molekulargewichtsbestimmung von polymeren Verbindungen dar. Auch in der Detektion und Analytik von DNA hat sich die MALDI-TOF Massenspektrometrie bewährt und bietet in zahlreichen Fällen, insbesondere in Bereichen mit hohem Probenauf- kommen, bereits eine ernsthafte Alternative zur Gelelektrophorese. Im Vergleich zu gelelektrophoretischen Verfahren ist die Zeitdauer einer Messung in der Massenspektrometrie zur Dauer der enzymatischen Reaktion vernachlässigbar. Außerdem ist bei der Gelelektro- phorese ein Markieren oder Färben der Probe zur Detektion notwendig und die Molekulargewichtsinformation wird nur indirekt über den Vergleich von Mobilitäten von Vergleichsmolekülen gewonnen, während in der Massenspektrometrie der Analyt direkt und unmittelbar über seine Masse mit einer hohen Genauigkeit detektiert wird. Um das Auflösevermögen und damit die Massengenauigkeit weiter zu erhöhen, kann einmal der MALDI-Prozeß selbst durch die Entwicklung neuer Geräte optimiert werden. Daneben bietet die Suche nach neuen Matrices und der Einsatz von Nukleosidtriphosphatanaloga zur Stabilisierung des zu untersuchenden DNA-Fragmentes eine weitere Möglichkeit der Verbesserung. Durch chemische Modifikationen ist es möglich, Fragmentierungen von DNA unter Bedingungen der MALDI-TOF Massenspektrometrie zu unterbinden. So stellt zum Beispiel die Verwendung von N 7 -Deazapurintriphosphaten zur Synthese von modifizierten Nukleinsäuren eine sehr einfache Methode dar, die Qualität der Spektren auch auf bereits vorhandenen MALDI-TOF Massenspektrometern erheblich zu verbessern. [169]
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Chemische und enzymatische Synthese modifizierter Nukleinsäuren für die Analytik mit Hilfe der MALDI-TOF Massenspektrometrie

Chemische und enzymatische Synthese modifizierter Nukleinsäuren für die Analytik mit Hilfe der MALDI-TOF Massenspektrometrie

Es ist bekannt, daß DNA in Lösung nur eine begrenzte chemische Stabilität besitzt, wobei die N-glykosidische Bindung zwischen einer Purinbase und der Zuckereinheit die höchste Hydro- lyseempfindlichkeit aufweist. So findet man spontane Depurinierung mit nachfolgender Hydrolyse der Phosphodiesterbindung an den so entstandenen apurinischen Stellen unter physiologischen Bedingungen in Lösung erstaunlich häufig. Ein ähnliches Phänomen be- obachtet man auch bei der MALDI-TOF Massenspektrometrie von Oligodesoxyribonukleotid- fragmenten als einen entscheidenden Beitrag zur Verschlechterung der detektierten Signale. Insbesondere bei Oligodesoxynukleotiden mit hohem Desoxyguanosinanteil wurde das Auftreten von Signalen niedrigerer Massen, die durch Depurinierung verursacht wurden, beobachtet 57 . Als illustratives Beispiel zeigt Abbildung 2 das Massenspektrum eines 19-mer PCR-Primers. Neben dem Signal des Molekülions von (M+H) + = 5822 u ist eine Serie von
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Reverse Sanger-Sequenzierung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Reverse Sanger-Sequenzierung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Für eine erfolgreiche MALDI-TOF Analyse von Fragmentpopulationen aus Sequenzier- reaktionen ist eine schnelle und effiziente Aufreinigung der Reaktionsprodukte von großer Bedeutung. Einen besonderen Stellenwert haben dabei Aufreinigungsverfahren, die auf einer Immobilisierung der Probenmoleküle an eine feste Phase basieren. Sie weisen die für festphasengebundene Reaktionen allgemein bekannten Vorteile wie gute Reproduzier- barkeit, hohes Automatisierungspotenzial, hohe Effizienz und Spezifität etc. auf. Speziell die festphasengestützte Aufreinigung über das Streptavidin-Biotin-System [101] bietet vielfältige Anwendungsmöglichkeiten und konnte bereits zur Aufreinigung von LCR- [78] , PCR- [76,77,102] und Sequenzierprodukten [94] erfolgreich eingesetzt werden. Dieses System zur Isolierung Biotin-markierter DNA besteht aus uniformen superparamagnetischen Polystyrol-Partikeln von 2.8 µm Durchmesser, die über eine kovalente Bindung mit Streptavidin beschichtet sind (im folgenden auch Streptavidin-Beads genannt). Streptavidin ist ein bakterielles, von Streptomyces avidinii gebildetes Protein, das aus vier identischen Untereinheiten aufgebaut ist. Jede Untereinheit trägt eine hochaffine Bindungsstelle für Biotin bzw. Biotin-Konjugate. Obwohl der Streptavidin-Biotin-Komplex durch nicht-kovalente Bindungen gebildet wird, ist die Affinität von Streptavidin zu Biotin etwa um den Faktor eine Million stärker als die der meisten Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen (Kd = 10 -15 mol/l). Der Einsatz biotinylierter Templates in enzymatischen Reaktionen erlaubt eine schnelle und effiziente Isolierung der Biotin-markierten Targetmoleküle durch Immobilisierung an die Streptavidin-Dynabeads. Mit einem Magneten können die Streptavidin-beschichteten Partikel an der Gefäßwand zurückgehalten, und so leicht von Puffern, Lösungsmitteln, Enzymen oder unerwünschten Abbauprodukten separiert werden. Zeitaufwendige Methoden zur Isolierung und Reinigung, wie Präzipitation, Extraktion und Zentrifugation werden vermieden. Lässt sich die enzymatische Reaktion, z.B. bei der reversen Sanger Sequenzierung, direkt als Festphasensequenzierung an den Beads durchführen, können zudem Reaktion und anschließende Aufreinigung ohne größeren Substanzverlust in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Nach der Aufreinigung an der festen Phase können die Analytmoleküle wieder freigesetzt und massenspektrometrisch detektiert werden.
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Evaluierung des strukturaufklärenden Verfahrens MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Identifizierung von filamentösen Schimmelpilzen / eingereicht von Thuy Huyen Le

Evaluierung des strukturaufklärenden Verfahrens MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Identifizierung von filamentösen Schimmelpilzen / eingereicht von Thuy Huyen Le

Klinische Labore, welche das System implementierten, sprachen sich insbesondere für den Zeitaspekt einer MALDI-Analyse aus. Es wurde berichtet, dass Diagnosezeiten deutlich verkürzt werden konnten, was jedoch in erster Linie auf die direkten Verfahren zurückzuführen ist, in denen Proben vom Festmedium entnommen und analysiert wurden. Die Verwendung von Übernacht-Flüssigkulturen, so wie es vom Hersteller vorgeschlagen wird, bringt daher in einigen Fällen hinsichtlich des Zeitaspekts eher einen nachteiligen Effekt mit sich. Angesichts der Inkubationszeiten in Flüssigbouillon zeigten die meisten Aspergillus und Mucorales-Arten nach etwa mehr als einem Tag ausreichendes Hyphenwachstum.
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Evaluation und Optimierung eines neuen, semi-quantitativen Testes zur schnellen Antibiotika-Resistenzbestimmung mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie an klinischen Proben

Evaluation und Optimierung eines neuen, semi-quantitativen Testes zur schnellen Antibiotika-Resistenzbestimmung mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie an klinischen Proben

Insgesamt wachsen Non-Fermenter im Vergleich zu Enterobacteriaceae langsamer, weisen offenbar weniger ribosomale Proteine auf, welche diejenigen sind, die im MALDI-TOF Massenspektrum detektiert werden 64,65 . Dies resultiert in geringere In- tensitäten im generierten Spektrum, folglich auch in einen geringeren Wert für das „absolute Wachstum“ der automatisierten Auswertung. Dies ist schließlich der Dis- kriminationsfähigkeit des Testes für Spezies mit längerer Generationszeit abträglich, da ein Unterschied im Wachstum nicht so deutlich hervortritt. Weil unter den fünf auf- getretenen P. aeruginosa (darunter ein Paar von demselben Patienten im Rahmen der Doppelbestimmungen) nur ein gegen Ciprofloxacin auch nur knapp resistentes Isolat war, ist die Stichprobe für endgültige Aussagen zu klein. Diese Studie lässt trotzdem die Vermutung zu, dass andere Versuchsbedingungen zu eindeutigeren Ergebnissen führen könnten. Eine höhere Einsaat, längere Inkubationszeit oder das Festlegen eigener Grenzwerte erscheint als Lösung denkbar (vgl. Kapitel 3.6 und 4.3.4). In Versuchen aus der Subkultur mit denselben Isolaten, zeigten diese schon nach 2,5 Stunden im Kontrollansatz ausreichendes Wachstum, wenn eine optische Dichte von 0,007 (statt 0,0035) eingesetzt wurde. Allerdings war in diesem Ansatz der resistente Stamm ganz eindeutig falsch empfindlich. Bei einer Einsaat von OD= 0,01 konnte für alle 4 Stämme die korrekte Zuordnung erfolgen. Der resistente Erre- ger konnte bei einer OD= 0,02 noch deutlicher als solcher herausgearbeitet werden, bei korrekter Zuordnung auch der empfindlichen Isolate. Für Antibiotika mit steiler ti-
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Methodenentwicklungen zur Analyse und Charakterisierung komplexer kosmetischer Rohstoffe mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie: Untersuchung von Paraffinen, Wollwachs und Wollwachsprodukten und kohlenhydrat-basierten Polymeren

Methodenentwicklungen zur Analyse und Charakterisierung komplexer kosmetischer Rohstoffe mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie: Untersuchung von Paraffinen, Wollwachs und Wollwachsprodukten und kohlenhydrat-basierten Polymeren

Eine Schwierigkeit bei dieser Interpretation ist, dass die Diester im Prinzip die gleichen Molmassen wie die Monoester aufweisen plus ein Vielfaches von 14 Masseneinheiten. Dadurch könnte es sich also auch prinzipiell um die Monoester handeln. Jedoch bilden sich bei etwa 1000 Da neue Maxima aus und auch die angenommene Kettenlänge spricht dafür. Ein Monoester mit einer Molmasse von etwa 1000 g/mol müsste eine Gesamtkettenlänge von 64-66 aufweisen, d. h. die Kettenlängen von Alkohol und Säuren in dem Ester müssten jeweils 32-33 betragen. Die mittleren Kettenlängen bei den Alkoholen liegen bei ca. 18-26 und bei den Säuren zwischen 16 und 24 [2, 89]. Damit ist es unwahrscheinlich, dass Monoester aus diesen Komponenten ein Maximum bei einer Gesamtkettenlänge von 64- 66 C-Atomen bilden. Es kann eher angenommen werden, dass es sich bei diesen Verteilungen um Diester handelt. Deren Intensität ist dabei relativ klein. Zum einen, weil die Konzentration der Diester im Wollwachs recht gering ist und zum anderen diese durch ihre unpolarere Natur noch schwerer zu ionisieren sind als die Monoester. Prinzipiell sind auch Triester aus den vorliegenden Hydroxysäuren und Alkoholen bzw. Diolen möglich [2], die aber aufgrund ihrer geringen Menge im Wollwachs im LDI-TOF Massenspektrum nicht abgebildet werden. Weiterhin sind in den Spektren immer wieder Peaks zu erkennen, die sich mit Cholesterin bzw. einem Spaltprodukt aus einem Cholesterylester erklären lassen. Cholesterin ist das am häufigsten vorkommende Sterin in Wollwachs und stellt zwischen 30 und 40 % des Unverseifbaren in Wollwachs dar [89, 90]. Das Lithiumaddukt von Cholesterin ist bei m/z 393 zu finden. Der Peak bei m/z 368 kann durch eine Spaltung eines Esters aus Cholesterin und einer Wollwachssäure entstanden sein. In diesem Falle handelt es sich dann nicht um ein Protonen- oder Kationen-Addukt, sondern vielmehr um ein Fragment, das vor oder während der Ionisation entstanden ist. Aufgrund der höheren Elektronegativität der Säure verbleibt das Cholesterin als ein [M-H 2 O]· + Ion.
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Neue methodische Konzepte beim Einsatz der MALDI-(TOF)-Massenspektrometrie zur Analyse technischer Polymere sowie tensidischer Produkte auf Basis nachwachsender Rohstoffe

Neue methodische Konzepte beim Einsatz der MALDI-(TOF)-Massenspektrometrie zur Analyse technischer Polymere sowie tensidischer Produkte auf Basis nachwachsender Rohstoffe

Ein weiterer Schwerpunkt lag in der Erprobung und Weiterentwicklung der lö- sungsmittelfreien Probenvorbereitung. Durch eine gleichmäßigere Belegung der Tar- getoberfläche mit Matrix und Probe kam es zu einer besseren Reproduzierbarkeit der einzelnen Massenspektren, was in Hinblick auf eine quantitative bzw. semi- quantitative Analyse mittels MALDI-MS erforderlich ist. Untersuchungen zum Ein- fluss der Matrix und des Targetmaterials zeigten, dass im niedrigen Massenbereich (z.B. bei niedrigethoxylierten Fettalkoholen) Matrix-Alternativen wie Aluminium- oxid oder Oxalsäure, die nicht dem klassischen MALDI-Konzept entsprechen, zur Laser-Desorption/Ionisation verwendet werden können. Zwar hat das Targetmaterial keinen Einfluss auf den MALDI-Prozess einer lösungsmittelfrei vorbereiteten Probe, jedoch zeigte sich, dass eine bestimmte Oberflächenstrukturierung des Targets sich sehr stark auf die resultierenden Massenspektren auswirkt. Zusätzlich zu den erhal- tenen Massenspektren konnten die Ergebnisse durch Visualisierung der Targeto- berfläche mit Hilfe von REM-Aufnahmen bestätigt werden. Eine Weiterentwicklung der lösungsmittelfreien Probenvorbereitung war das Aufbringen des Analyt/Matrix- Gemisches in eine Ausfräsung des Targets. Damit ergab sich eine homogene, gleich- mäßige Verteilung von Probe, Matrix und Salz und eine daraus folgende gute Laser- schuss-zu-Laserschuss-Reproduzierbarkeit. Zudem konnte anhand dieser Ergebnisse die Theorie widerlegt werden, dass eine Wechselwirkung des Laserlichtes mit der Oberfläche des Targets für den MALDI-Prozess im niedrigen Massenbereich not- wendig ist.
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Vergleichende Differenzierung von Clostridium spp. mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden sowie MALDI-TOF Massenspektrometrie

Vergleichende Differenzierung von Clostridium spp. mittels biochemischer und molekularbiologischer Methoden sowie MALDI-TOF Massenspektrometrie

In der Regel sollte hierbei eine Untersuchung auf die vier für die Humanmedizin bedeutendsten Toxintypen A, B, E und F ausreichen. Parallel zur PCR wird ein Ausstrich der Anreicherung auf festen Nährmedien wie Blutagar oder Eigelb-Laktose- Agar angefertigt und dieser 48 h anaerob bei 30 °C bebrütet. Nach erfolgreicher Bebrütung wird erneut eine Real-Time PCR von verdächtigen Kolonien im Hinblick auf das Vorhandensein der BoNT-Gene durchgeführt. Kolonien mit positivem PCR- Ergebnis können mittels MALDI-TOF MS oder mit biochemischen Testsystemen bestätigt werden. Gegebenenfalls empfiehlt es sich, das Toxinbildungsvermögen BoNT-Gen-positiv getesteter Keime mittels Maus-Bioassay nachzuweisen. Allerdings gilt allein ein Zusammenhang zwischen BoNT-Gen-positiven C. botulinum-Stämmen im Lebensmittel und gleichzeitig vorhandenen Erregern im Stuhl des Patienten - oder lediglich die Ausbildung charakteristischer Symptome beim Patienten - schon als lebensmittelrechtlich beanstandbar. In Abb. 12 wird der schematisierte Ablauf einer Untersuchung auf C. botulinum dargestellt.
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Anwendung und Optimierung der lösungsmittelfreien Probenvorbereitung in der MALDI-(TOF)-Massenspektrometrie zur quantitativen Analyse

Anwendung und Optimierung der lösungsmittelfreien Probenvorbereitung in der MALDI-(TOF)-Massenspektrometrie zur quantitativen Analyse

Während des Matrixscreenings unter Einsatz der DD-Probenaufgabe wurden mit DABP als Matrix ausschließlich qualitativ minderwertige Massenspektren erhalten, in welchen teilweise keine Signale für die Maltodextrine detektiert werden konnten. Bei der Hauptkomponentenanalyse wurden daher für DABP die geringsten Scores erzielt, während bei Verwendung der CS-Technik völlig gegensätzliche Ergebnisse erhalten wurden. Als Begründung lassen sich an dieser Stelle nur Vermutungen anstellen, welche die Kristallmorphologie von DABP bei der DD-Technik betreffen. So könnte durch eine unterschiedliche Kristallisation von Matrix und Analyt, möglicherweise auch bedingt durch die Wahl des Lösungsmittels, der notwendige Kontakt zwischen den beiden Komponenten ausbleiben, weshalb bei der MALDI- Analyse keine hinreichende Desorption des Analyten von der Targetoberfläche stattfindet. Bei der Compressed-Sample-Technik hingegen wird durch die Vermahlung von Matrix und Analyt der Kontakt zwischen den Komponenten hergestellt, sodass der klassische MALDI-Prozess zum Tragen kommen kann.
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Systematischer Vergleich von Methoden zur schnellen Identifizierung von Bakterien aus Blutkulturproben mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie

Systematischer Vergleich von Methoden zur schnellen Identifizierung von Bakterien aus Blutkulturproben mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie

Durch die schnelle zielgerichtete Antibiotikatherapie bei bakteriämischen Patienten können Mortalität und Antibiotikaverbrauch reduziert werden. Die beschleunigte Erregeridentifizierung trägt dabei maßgeblich zur Reduktion der Zeit bis zur Einleitung einer pathogenspezifischen Behandlung bei. In den letzten Jahren wurden verschiedene Verfahren zur direkten Erregeri- dentifizierung aus positiven Blutkulturen mittels MALDI-TOF Massenspekt- rometrie publiziert. Wegen des hohen Aufwands der Verfahren liegen aller- dings nur wenige Paralleluntersuchungen mit unterschiedlichen Protokollen vor und Leistungsvergleiche zwischen den Arbeiten sind wegen der gerin- gen Zahl an Veröffentlichungen zu einzelnen in-house-Protokollen und der zum Teil beträchtlichen Heterogenität der Arbeiten im Hinblick auf die ver- wendeten Bewertungskriterien und das untersuchte Probenkollektiv schwierig.
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Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Makromolekülanalytik

Gutenberg Open Science: Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Makromolekülanalytik

Die detaillierte Interpretation der PSD-MALDI-TOF-Fragmentspektren der Proben ohne Metalltrifluoracetatzugabe zeigt die größte Hauptfragmentsignalintensität bei einem mittleren Molekulargewicht von 3371 Da und wird der Struktur 28.II (Abb. 3-101, S. 187) zugeordnet. Damit zeigt sich der intensivste Fragmentierungspfad für den ISD- und PSD-Mechanismus identisch. Das zweit intensivste PSD-Fragment bei einer mittleren Masse von 3328 Da entspricht der Struktur 28.II, bei der zusätzlich eine Fragmentierung der Propylseitenkette eingetreten ist. Dieser Seitenkettenfragmentbruch erscheint an Struktur 28.II relativ bevorzugt, da mindestens eine vierfache Propylfragmentkaskade ausgehend von dieser Struktur gefunden wird. Das nächst intensive Fragmentsignal erweist sich als Struktur 28.III, bei der der Bindungsbruch an der Kohlenstoff- Stickstoffheteroatombindung der Amidgruppe erfolgt. Aus diesen beiden prominentesten Fragmenten 28.II und 28.III lässt sich schließen, dass der Bindungsbruch bevorzugt an Kohlenstoff- Heteroatombindungen im biotinhaltigen Dendron stattfindet. Die aufgrund der in Kapitel 3.4.3.5 durchgeführten Untersuchungen an Dendrimeren mit tetraedrischem Kern zu erwartende Abspaltung eines intakten Dendrons, bei der Fragmentstrukturen 28.IV und 28.V gebildet werden, wird ebenfalls mit guten Signalintensitäten gefunden. Dabei wird die Fragmentstruktur 28.V mit etwas intensiveren Signalen als 28.IV gefunden. Dies ist wahrscheinlich nicht nur statistisch bedingt, sondern ebenfalls durch die Tatsache, dass das biotinhaltige Dendron bevorzugt Kohlenstoff-Heteroatombindungsbrüche eingeht, die wie oben beschrieben die Hauptfragmentsignale im PSD-MALDI-TOF- Fragmentspektrum liefern. Daher werden am heteroatomhaltigen Dendron eher Kohlenstoff- Heteroatombindungen gebrochen als die Bindung am tetraedrischen Kohlenstoff. Damit steht auch im Einklang, dass die Struktur 28.VI mit starker Signalintensität gefunden wird, bei der der bevorzugte Bindungsbruch der Esterbindung im biotinhaltigen Dendron und der Kohlenstoff- Kohlenstofffragmentbruch eines intakten perylenhaltigen Dendrons am tetraedrischen Kohlenstoffkern auftritt. Die Strukturen 28.V und 28.VI haben mit Struktur 28.II gemeinsam, dass sich Kaskaden an Propylseitenkettenfragmentierungen der perylenhaltigen Dendronen nachweisen lassen.
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Rapid Discrimination of Salmonella enterica Serovar Typhi from Other Serovars by MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Discrimination of Salmonella enterica Serovar Typhi from Other Serovars by MALDI-TOF Mass Spectrometry

Cells were grown over night on sheep blood agar (Oxoid, Wesel, Germany) at 37 uC under safety conditions as required, prepared in duplicate for ICMS by smear preparation and overlaid with HCCA matrix, both under a safety cabinet and after drying transported to the MALDI device. ICMS was done by standard procedures recommended for the BioTyper 3.0 system (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). For analysis, 600 spectra from 2– 20 kDa were gathered in 100-shots steps. Results with score values .2.000 were considered correct. Analyses for isolates not yielding a significant score were repeated once by smear preparation and in the case of 22 (all non-Salmonella) isolates subsequently by formic acid-acetonitrile extraction. All ICMS identification experiments were done in a blinded form. In 15 cases 16 S rDNA sequencing was used as a tie-breaker for discordant or unclear results.
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Effects of sample fixation on specimen identification in biodiversity assemblies based on proteomic data (MALDI-TOF)

Effects of sample fixation on specimen identification in biodiversity assemblies based on proteomic data (MALDI-TOF)

Recently, MALDI-TOF mass spectrometry has been used to reliably identify taxonomically difficult harpacticoid copepods from sediment samples. In agreement with former studies, a negative impact of short storage periods was stated. Other studies reported inferior mass spectra quality from samples fixated in varying ethanol concentrations. Therefore, sediment samples from a mudflat sampling site in the North Sea were stored under different temperature conditions to explore possible storage effects. Samples were fixated with either 70 or 100% ethanol and specimens were measured using MALDI-TOF mass spectrometry after 1, 2, 3, 5, 7, and 12 weeks. The changes in number of peaks per species and the ability to identify specimens based on mass spectra were analyzed quality measurements. We show that storage temperature had a major impact on data quality, as for some species a loss of up to 50% of mass peaks and an increase of failed measurements to over 70% was observed. However, the effect of different ethanol concentrations on data quality was negligible. Concluding from these results, storage of metazoan samples in general and, particularly, of sediment samples at low temperatures of around −25 ◦ C is recommended to receive high-quality mass spectra for specimen
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OPUS FAU | Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung von Modifikationen des alpha-s1-Caseins in Milch mittels MALDI-TOF-MS

OPUS FAU | Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung von Modifikationen des alpha-s1-Caseins in Milch mittels MALDI-TOF-MS

Während für den Verdau von a s1 -Casein GluC am besten geeignet ist, hydrolysiert das Enzym Chymotrypsin b-Casein theoretisch zu Peptiden mit gut geeigneter Länge. Lei- der konnten nach Verdau von b-Casein (und ebenso nach einem Verdau von a s1 -Casein) mit Chymotrypsin keine oder nur wenige einzelne der erwarteten 0 MC- und 1 MC- Peptide nachgewiesen werden. Dabei wurde von verschiedenen Spezifitäten des Enzyms ausgegangen, insbesondere einer Hydrolyse der Peptidbindung nach Phenylalanin, Ty- rosin und Tryptophan sowie von einer solchen nach zusätzlich einer oder mehreren der übrigen Spaltstellen (vgl. Tab. 1.3). Darüber hinaus wurde versucht, anhand der erhal- tenen Peptide eine Spezifität abzuleiten; dies gelang aber leider nicht. Auch verschiede- ne Puffersysteme (Tris-HCl-Puffer mit CaCl 2 -Zusatz, Bicarbonatpuffer), Verdauzeiten (1 h - 15 h) und MALDI-Matrices (CCA, DHAP) wurden eingesetzt, zusätzlich wur- de im negativen Modus vermessen. Auch Chymotrypsin von einem anderen Hersteller brachte keine Verbesserung der Ergebnisse. Abschließend wurden die Caseine vor und nach dem Verdau enzymatisch dephosphoryliert, was leider ebenfalls zu keiner Verbes- serung führte. Der als „Positivkontrolle“ mitgeführte Verdau von b-Casein mit GluC lieferte hingegen die erwarteten Peptide. Daher musste von der Verwendung von Chy- motrypsin abgesehen werden. Der Vergleich der übrigen Verdauenzyme analog zu Kap. 2.3.1 im theoretischen Verdau ergab für den Verdau von b-Casein mit GluC im Phos- phatpuffer die besten Resultate.
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Entwicklung und Applikationen einer DIP-APCI Ionenquelle zur direkten Analyse mittels Q-TOF- und Ion Trap-Massenspektrometrie

Entwicklung und Applikationen einer DIP-APCI Ionenquelle zur direkten Analyse mittels Q-TOF- und Ion Trap-Massenspektrometrie

The possibility of performing quantitative analyses using the DIP-APCI ion source was shown by the determination of coumarin in cinnamon employing the DIP-APCI-Q-TOF-MS coupling. The DIP-APCI-MS determination of coumarin in cinnamon following extraction was validated and showed satisfying linearity, recovery and reproducibility, both using deuterated coumarin as internal standard and without the use of an internal standard. When deuterated coumarin was used as internal standard, the coumarin contents determined in different cinnamon samples by DIP-APCI-MS were in good agreement with the results obtained by a complementary LC-MS analysis. When no internal standard was used high coumarin contents were overestimated in the LC-MS analysis and underestimated in the DIP-APCI-MS analysis. This shows that the use of deuterated coumarin as internal standard is advisable to obtain accurate data with both methods. The determination of coumarin in woodruff-flavored beverages showed that, using ambient ionization mass spectrometry, special attention has to be paid to possible spectral interferences. By means of LC-MS, coumarin could not be detected in the woodruff-flavored liquor analyzed. Due to the influence of the high temperature applied to the woodruff-flavored liquor during DIP- APCI-MS analysis an isobaric artefact was formed. The temperature-programmed vaporization in combination with the use of deuterated coumarin as internal standard helped in recognizing this spectral interference.
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Darstellung massenmodifizierter 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphoshate für die DNA-Analyse mittels MALDI-TOF-MS

Darstellung massenmodifizierter 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphoshate für die DNA-Analyse mittels MALDI-TOF-MS

MALDI-TOF MS has been proposed as substitute for the gel electrophoretic separation and detection for sanger sequencing products. Due to the high accuracy for the analysis of smaller fragments and the speed of the method there is a high potential for diagnostic applications, e.g. analysis of gene products, genetic mapping and genetic defects. Further improvements in this field could be expected of the use of mass tagged terminators, which may allow multiplex- sequencing via MALDI-TOF-MS. Therefore the main object of this study was to investigate to which extent mass tagged terminators can be employed for the DNA-analysis via MALDI- TOF-MS. For this purpose mass resolution and sensitivity of MALDI-TOF-MS analysis of synthetic oligonucleotides, complex mixtures of oligonucleotides and PCR products were examined. In cooperation with C. Siegert the influence of 7-deazapurine moieties on ion stability of nucleic acids during the MALDI process was studied. Clearly increased sensitivity and higher mass resolution for 7-deazapurine-modified PCR products could be demonstrated. Additionally, the formation of homo/heterodimeric and double stranded ions was examined and it could be shown for the first time that the detection of intact double stranded DNA with MALDI-TOF-MS is also possible (matrix: 3-hydroxy picolinic acid). Analysis of complex mixtures of oligonucleotides indicated that for multiplex assays with the given instrument (Vision 2000, Finnigan) mass differences between the terminators of 40 – 150 Da in the mass region from 6-15 kDa should be useful (increasing with increasing mass). Above 15 kDa mass resolution decreases dramatically. Therefore the use of mass tagged terminators for multiplex sequencing is at present limited to small fragments up to ~30 nt, which is absolutely sufficient for diagnostic applications.
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Analysis of Lipids in Biological Tissue by LC-MS and MALDI-TOF Mass Spectrometry Imaging

Analysis of Lipids in Biological Tissue by LC-MS and MALDI-TOF Mass Spectrometry Imaging

Until analysis, the sagittal 8-11 µm thick tissue sections of mouse brain tissue sections had been stored at -80°C. Having been thaw-mounted onto stainless steel plates, they first had to be coated with 1,5-DAN matrix for 5 minutes, recrystallised with toluene for 45 seconds, and fixed onto a MALDI steel target (see section 3.4.2.). After the sample preparation, the MALDI TOF MSI analysis was conducted (see section 3.2.3.). The obtained spectra were averaged, peak picking was done at S/N > 3, while deisotoping was applied as well. A further KMD plot (see section 1.2.2.) could determine the lipid relevant area in the spectrum. Between m/z 600- 656, signals with no characteristic lipid mass defect of .5 to .8 could be detected. According to Meisenbichler et al. 10 , these signals derived from 1,5-DAN.
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