Ipari biotechnológia kulcslépései

BIOPROCESSING

„BIO-FELDOLGOZÁS”

Ipari biotechnológia kulcslépései

3. Downstream

processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése

Nyersanyag

Nyersanyag előkészítés

Fermentáció, biotranszformáció

Termék termék

kinyerés, kiszerelés

1. Upstream processing: a nyersanyag előkészítése a fermentációra, vagy

transzformációra

2. Fermentáció,transzformá- ció: bioreaktorokban

sejtszaporítás,

antibiotikum, fehérje, stb.

előállítás

1. Upstream

- bioreaktorok - tápanyagok - sterilizálás - oxigénellátás

- aerob/anaerob fermentálás

2. Downstream

- sejt izolálás - feltárás

- extrakció

- fehérje tisztítás - kiszerelés

- melléktermékek, hulladék kezelés

Fermentáció

• A gyógyszer-, élelmiszer-, és vegyiparban használt (bio-) termékek előállításában a mikrobiális fermentációknak nagy jelentőségük van

• Fermentáció hatékonysága sajnos gyakran elmarad a teoretikus maximumtól

• Mikroba fiziológia

• Rekombináns sejtekkel történő fermentációk

• Mikrobiális konverziók – fermentáció

• Enzimatikus folyamatokon alapuló konverzió – biokonverzió

• Fermentor– reaktor, melyet mikrobiális konverziókra haszn.

Fermentációs eljárások típusai

Nyílt és zárt rendszerek

• Szakaszos fermentáció (Batch)

– a reaktánsokat (tápanyagok, sejtinokulum, gázok – folyamatos

levegőztetés) együtt visszük a rdsz-be a fermentáció megkezdése előtt – alapvetően zárt rdsz

– térfogat állandó

– Egyszerű eljárás, de termékgátlás ill. szubsztrát gátlás lehetséges

• Rátáplálásos szakaszos fermentáció (Fed-batch)

– a tápanyagokat folyamatosan adagoljuk (szubsztrát gátlás elkerülése) – a térfogat nő, mert nincs elvezetés

• Folytonos fermentáció (continuous)

– nyitott rdsz

– amennyi tápanyagot bejuttatunk, annyi térfogatnyit el is veszünk – paraméterek állandóak

• Félfolytonos fermentáció (semicontinuous)

– szakaszos fermentációk sorozata, melyben a fermentlé kb 10%-át a

bioreaktorok

• Központi szerep, a bioreakciók helyszíne

• Fontos a sejt kinetika, anyagtranszfer, folyadék keveredés a bioreaktor tervezéshez

• Bioreaktor – hardware és software szabályozás, a mikroorg.

számára fontos környezeti faktorok szinten tarthatók

– Kultúra paraméterei: hőmérséklet, keverési sebesség, nyomás, gázáram, pH, pO2, esetleg pCO2, hígulás mértéke

– Nagy felbontású (elsősorban laboratóriumi, az optimalizáláshoz)

bioreaktorokba lehet on-line optikai denzitás mérés, szubsztrát konc.

meghat.

Bioreaktor konfigurációk

A bioreaktor (fermentor) egy edény, melyben a biológiai reakciókat

kivitelezzük:

• mikroorganizmus szaporítása, enzim- vagy immobilizált sejtes reakciók, szövettenyészetek

• méret: 0,5-2 000 000 l

• üveg-rozsdamentes acél, esetleg műanyag

• Alapvető paraméterek nyomon- követhetők

• Mintavételezési lehetőség

• Kevertetés -nyíróerők

Bioreaktor konfigurációk

1. Görgetett edény

• Ált. műanyagból

• Horizontális kialakítású, lassú keveréssel

• Megfelelő levegőztetés, anyageloszlás érhető el

• A sejtek a henger belső felszínéhez tapadva

szaporodnak, nem lepi el folyamatosan a

tápoldat

• A töltet a henger térf.

max 30%-a lehet

• Olcsó, de a kontroll, és monitor nem hatékony

Bioreaktor edény

Szabályozó egység

Görgető rendszer

2. Kevertetett tank bioreaktorok

• Leggyakrabban használt típus

• Mechanikus keverő rdsz-rel ellátott

• Rozsdamentes acél (kisebb térf-nál lehet üveg)

• Magasság:átmérő arány (1:1, 3:1)

• Keverés keverőlapátokkal, azok kialakítása a nyíróerők szempont- jából fontos

• Levegőztetés megoldása

• Sejtek denzitása ált. 10⁶-10⁷ sejt/ml, de ez javítható akár több

nagyságrenddel is

• Mérete akármeddig nem növelhető a keverés, oxigénellátás, hőmérséklet tartás miatt

Bioreaktor konfigurációk

Kevert tankreaktor (angol: stirred tank

bioreactor ‘STB’)

3. Air-lift bioreaktorok

• Egyszerű, olcsó

• A reaktor belsejében egy központi cső, un. emelő (riser), és egy külső

hengeres gyűrű un.

levezetőcső (downcomer)

• Fertőzés veszély is csökken

• Sejtek denzitása ált. 10⁶ sejt/ml

Bioreaktor konfigurációk

távozógáz

Belső cső elem a gáz áramlás biztosítására

Gáz buborék

Gáz elosztó áramlásmérő

Gáz beinjektálása

4. Fluid-ágyas bioreaktor

• Hordozó, sejtaggretátok, kisebb térfogat (max 100 L)

• nagy sejtmennyiséggel – szuszpendált és kitapadó sejtek is

• Transzport folyamatok - nem elég hatékony

• Fejlesztés kollagén mikrohordozóval jó eredmények

• Reciklizáló cső

• Sejtek denzitása ált. 10⁸ sejt/ml

Bioreaktor konfigurációk

5. Üreges szálas-bioreaktorok

• Egyszerű, de max néhány liter

• Kapilláris szálak egy henger

testben, mindkét végén tapadnak

• A sejtek a kapillárisok közötti térben szaporodnak (szövetszerű)

• Főleg humán sejtkultúrák számára

• Sejtek denzitása 10⁸ sejt/ml

• Termék visz. tisztán nyerhető

Bioreaktor konfigurációk

7. Fix ágyas bioreaktorok

• A sejtek hordozóhoz (pl. aktív szén) kötötten, vagy polimerbe csomagoltan

• Fluid ágyassal szemben előny a stabilitás

• Hátránya, hogy a transzport folyamatok mértéke kisebb, grádiens alakulhat ki a bioreaktorban

(nem lesz homogén a rdsz)

• Sejtek denzitása ált. 10⁶-10⁷ sejt/ml

• Termék kinyerése nehézkesebb 1. Kerámia ágyas bioreaktorok

• Kerámia hordozó, újrahasználható, költséghatékony

• Jó minőség, hőmérséklet tolerancia

• Széles körű felhasználás

• Inhomogenitás lehet a reaktorban

• Sejtek denzitása ált. 10⁷-10⁸ sejt/ml

Bioreaktor konfigurációk

keverés

• Mechanikus propellerek segítségével

• Levegő áramoltatás segítségével

bioreaktor

termék

hőcserélő

keverés

• Feladata a megfelelő anyagtranszport fenntartása, azaz a beáramló levegő, a tápoldatban oldott (vagy nem oldott) tápanyagok, és a keletkező termékek egyenletes

eloszlatása

• Az egyes oldatok viszkozitása szintén befolyásolja a

keverés módját, mértékét. Ez az időben változhat, egyrészt a szaporodó mikróbák, valamint a keletkező termék miatt.

• A kevertetés mértéke akármeddig nem növelhető a nyíróerők miatt

• A keverés sebességét és a levegőztetés sebességét

egymást figyelembe véve kell optimalizálni (ne alakuljanak ki légüregek)

Propeller fajták

levegőztetés

Eltérő oxigénigény

• aerob/anaerob szaporítás

• baktériumok/gombák

• enzimes/sejtes folyamatok Oldott oxigén szint

• oldhatóság mértéke hőmérséklet függő

Buborék méret

• túl nagy buborék – hiába

juttatunk sok levegőt be, nem hasznosul

• intenzív keveréssel lehet apró buborékokat nyerni

• eleve apró buborékképzés - pezsegtetés

belső külső

oxigénellátás

tápközeg

Szilárd v. folyékony

Természetes, félszintetikus, szintetikus Tápanyagok:

• Szén-, energiaforrás

• Nitrogénforrás, egyéb ásványi anyagok

• Mikroelemek

• Vitaminok

• Növekedési faktorok

Szén-, és energiaforrások

Természetes:

– melasz: a cukorgyártás mellékterméke. ~ 50%

cukortartalom, de emellett jelentős nitrogénforrás is – sajt/tej permeátum: 6-7% szárazanyagtartalom, főleg

laktóz, kevés zsír, fehérje, ásványianyagok

– Magáztató folyadék (corn steep liquor-CSL): a magok

nedves őrlése során keletkezik, cukrok és kismolekulasúlyú N tartalmú vegyületek

– Manióka v. cassava: 20-40% keményítő, kevés fehérje, zsír – Bagasse: cukornádból a cukor kinyerése után visszamaradó

rostos anyag

Drágább, de természetes alapú alapanyagok:

– húskivonat: fehérjéket, aminosavakat tartalmaz. Húsleves bepárlásával állítják elő. Lekvárszerű illetve por alakú

– pepton: fehérjék savas vagy enzimatikus hidrolízisével állítják elő. Vízben könnyen oldódik. A fehérjék tripszines lebontásával (mely egészen az aminosavakig megy)

keletkező magas triptofán tartalmú pepton a Trypton – Élesztőkivonat

Pontos összetételük nem mindig ismert, változhat, ezért pl.

laborban a kísérletek kivitelezése során inkább jól definiált alapanyagokat használunk

Szén-, és energiaforrások

Nitrogén források

• Szervetlen:

– nitrát sók, ammónium sók

• Szerves

– Kukoricalekvár: a kukoricaszem áztatása során keletkező áztatólé 50%-ra töményítve

– Húskivonat – Pepton, tripton

egyebek

• Szervetlen ionok:

– Foszfor, kén, vas, nyomelemek

• Növekedési faktorok:

– melyekre a mikróbáknak szükségük van szaporodásukhoz, de szintetizálni nem tudják

• Szelektív ágensek:

– Specifikusak az adott mikrobára, másokra gátló hatásúak

• Habzás gátlók

– csökkentik a felületi feszültséget (a folyadék-gáz határfelületen), ennek következtében a légbuborékok átmérője kisebb lesz

• Szelektív körülmények

– Pl. szén-, nitrogén forrás limitáció- elősegítheti bizonyos anyagok intenzívebb termelődését, extracelluláris termékek képzése

– Van elég szénforrás, de kevés a nitrogén forrás poliszaharid, PHA felhalmozás (akkumuláció) lehet

• Szennyező mikroorganizmusok elpusztítása a fermentáció előtt

– Hőkezelés, sugárzás (UV, gamma), kémiai ágensek, ultrahang, szűrés

– Hőkezelés gőzzel, ha nyomást is tudunk alkalmazni, jobb a hatékonyság, rövidebb idő elég (teszt organizmus

Bacillus stearothermophilus)

– Spórák elpusztítása érdekében néha többszörös sterilezés szükséges, ez azonban károsíthatja a tápanyagokat (pl.

cukrok karamellizálódnak)

sterilezés (csíramentesítés)

sterilezés (csíramentesítés)

Tápoldat + gáz sterilezés Folyadék

- szűrés/ülepítés

- kémiai-, hő- inaktiválás 1. Szűréssel:

- cellulóz alapú filterek, pórus átmérő igény szerint változó 0,2 - 0,45 mm

2. Inaktiválással:

- hőkezelés: teszt mikróba: Bacillus stearothermophilus hőérzékeny tápkomponensek

3. Kémiai:

hypo, formaldehid

oxidálószerek (pl. H₂O₂, peroxiecetsav)

Gáz

- szűrés

- UV, röntgen - kémiai

Mi szennyez?:

– penészgombák >> egyebek

– fágok kiszűrése még ma sem megoldott Szűrés

– filterek –hidrofób jelleg

– formaldehiddel átitatott üveggyapot

– kritikus sebesség/perc hatásfok igény: 0,5 - 1,5 térf.

sterilezés (csíramentesítés)

Fermentációs termékek

• Sejt pl. élesztő, SCP

• Elsődleges metabolitok pl. citromsav, etanol, glutaminsav (ált. 200 000 L kevertetett tank fermentorokban)

• Másodlagos metabolitok pl. antibiotikumok (ált. 50 000 – 200 000 L térfogatban)

• Enzimek (főleg extracelluláris, pl. amilázok, proteázok, lipázok. 30-220 m

térf)

• Terápiás fehérjék pl. interferon, növekedési hormon, inzulin…

• Vakcinák pl. hepatitis-, szamárköhögés ellen

termékkinyerés

Centrifugálás, ülepítés, szűrés - sejtek összegyűjtése

• Ha sejtalkotót, vagy intracelluláris terméket áll. elő szükséges a sejtek feltárása:

– mechanikai: örlő malom, ultrahang, nyomás – kémiai: szerves oldószerek, detergensek

– enzimatikus: lizozim (G+ baktériumokra, G- esetén SDS-sel együtt)

• Extrakció, filtráció, adszorbció, kicsapás

– Kis molekulák kinyerése pl. folyadék-folyadék extrakció

• Oldószeres –hidrofób termék esetén

• Detergens segítségével

– Filtráció – szűrőn áteresztjük, dializis

– Adszorbció - hordozóhoz kötjük a kinyerni kívánt anyagot

– Kicsapás – csapadékot képzünk pl. magas sókonc-val (pl. ammónium-szulfátos)

• Tisztítás

– Kromatográfia (álló- és mozgó fázis)

Sejtek összegyűjtése, koncentrálása

centrifugálással

Sejtek feltárása ultrahang (1), detergens (2),

nyomás (3), örlő malom (4) segítségével

Kromatográfiás folyamatok

• Kromatográfia elválasztási módszer.

• Kromatográfiában az állófázis (mely ált. porózus, nagy felülettel rendelk. anyag) és a mozgófázis (ált. folyadék vagy gáz) között megoszlanak az anyagok egyensúlyi állandójuk szerint.

• A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a befecskendezési ponttól a detektorig (érzékelő berendezés) jut.

• Az állófázissal erősebb kölcsönhatással

rendelkező anyagok később távoznak, mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők.

• Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb

tartományt foglalnak el.

Kromatográfia - gélfiltráció

• Molekula méret szerinti elválasztás

• Töltet: porózus szemcsék

– Természetes polimerek (pl. dextrán, agaróz) – Szintetikus polimerek (pl. poliakrilamid)

• Magas sókoncentráció mellett fehérjék képesek/hajlamosak poláros felszínhez kötődni

• A sókonc. csökkentésével a fehérjék leválnak a hordozóról, eltérő sókonc-nál hidrofób tulajdonságuknak megfelelően

Kromatográfia - Hidrofób kromatográfia

Kromatográfia - Affinitás kromatográfia

• Gélágy ligandja specifikus affinitással bír az

elválasztandó anyaghoz

• Az adszorbeált termék leválasztása pl.

sókoncentráció, pH

változtatás, vagy akár a ligandot az eluáló szerhez adjuk

• Erős kationcserélő oszlop:

a negatív töltésű

állófázison pozitív ionokat választunk el.

• Erős anioncserélő oszlop:

pozitív töltésű állófázison negatív ionokat

választunk el.

• Ioncserélő kapacitás függ az állófázison kötött

töltések számától.

• A termék leválasztására ellenionokat tart-ó eluenst haszn.

Kromatográfia - Ioncserés kromatográfia

kiszerelés

• Kristályosítás

– A kristály - csak egyféle anyag alkothatja a kristályrácsot

• Szárítás

– ált. nagy felületen forró levegővel

• Liofilizálás

– hőérzékeny termékekre: vitaminok, enzimek, vakcinák, mikróbák,

gyógyhatású fehérjék

• Csomagolás

• Hulladékkezelés