A bioremediációban résztvevő aerob mikroorganizmusok lebontási útvonalak redox enzimek

(1)

A bioremediációban résztvevő aerob mikroorganizmusok

lebontási útvonalak

redox enzimek

(2)

Bevezető

• A legtöbb szennyező esetén gyors és teljes elbontásukra jellemzően aerob feltételek mellett találunk példát

• Az aerob lebontás alapvető feltételei az aerob mikroorganizmusokban:

– A mikrobának kapcsolatba kell lépnie a szennyezőanyaggal, pl ha hidrofób vegyületről van szó, először felületaktív anyagot kell termelnie a sejtnek – A támadás egy oxidációs lépéssel kezdődik, az aktiváció és az oxigén

beépülése a kulcs reakció, melyet oxigenázok, peroxidázok katalizálnak – Lebontási útvonalak segítségével a vegyület olyan intermedierré alakul,

mely beléphet a központi anyagcsere útba pl. a trikarbonsav ciklusba

– A keletkező intermedierekből pl. acetyl-CoA, piruvát, szukcinát biomasszát képez

• Számos baktérium, gomba képes a szervesanyagok elbontására (biodegradáció, mineralizáció), átalakítására, vagy úgy, hogy közben szaporodik, vagy kometabolizmussal

• Az oxidációs reakciót oxigenázok, peroxidázok, lakkázok katalizálják

(3)

Forrás: H-J Rhem, G. Reed: Biotechnology vol 11b WOLFGANG FRITSCHE and MARTIN HOFRICHTER

(4)

Tipikus, a biodegradációban komoly szerepet játszó aerob baktériumok

• Ált kemoorganotróf fajok, melyek nagyon sokféle xenobiotikus komponenst képesek szén- és energiaforrásként hasznosítani

• Nem várhatjuk, hogy egy baktérium képes legyen minden vegyület bontására, így kevert közösségek segítségével érhetünk el jó

eredményt, így alakulhat ki egy erős biodegradatív potenciál

• Ez a degradatív potenciál és a környezeti faktorok fogják meghatározni a biodegradáció mértékét

• A legdominánsabb és legkönnyebben szelektálható baktériumok

környezetünkben a pseudomonasok (tudjuk, hogy a talajban jelenlévő mikroorg-k többségét nem tudjuk elővarázsolni laboratóriumban

szaporítással). Szintén jelentősek a Comamonas, Burkholderia, Xanthomonas fajok (G-negatív képviselők). Akár több, mint 100 szerves vegyületet is képesek szénforrásként hasznosítani.

• A G-pozitív baktériumok közül a legjelentősebbek a Bacillus és Rhodococcus fajok

(5)

Alifások szaporodással kapcsolt bontása

• Az alifások és cikloalifások lebontásában a kezdeti lépéshez O₂-re van szükség

• A konkrét lebontási folyamat a szubsztrát tulajdonságaitól, és a lebontásban résztvevő mikroorg enzimkészletétől függ

• A hosszabb szénláncú alkánok (C_10-24) lebontása ált nem gond, a rövidebb láncúak (C_<9) viszont toxikusak sok mikroorg számára.

• Oxidációjuk terminális vagy diterminális, az első a fő útvonal, alkohol, aldehid és zsírsav keletk, a zsírsavak -oxidációja során aztán acetil-CoA képz

• Az elágazások ált rontják a biodegr hatékonyságát

(6)

n -alkánok oxidációja

1 n-alkán monooxigenáz 2 alkohol dehidrogenáz 3 aldehid dehidrogenáz

(7)

• Aromás vegyületeket minden élő szervezet tud szintetizálni (pl aromás aminosavak, fenolok, kinonok), így nem meglepő, hogy a környezet- ben szennyezőként megjelenő aromás vegyületeket is képesek bontani.

• Az aromások enzimatikusan természetes intermedierekké alakulnak:

katekol, protokatekol, melyek a központi anyagcsere útvonalakon alakulnak tovább sejtanyaggá

• Az első lépés a benzol gyűrű oxidációja, mely egy hidroxiláció vagy epoxidáció, amit oxigenáz enzimek katalizálnak

• Az aromások lebontásáért felelős enzimek többsége katabolikus

plazmidokon kódolt, melyek egyik gazdából a másikba át tudnak jutni (önállóan), és széles a gazdaspektrumuk. A legtöbb szennyezet

környezetből származó G-negatív talajlakó baktériumból lehet ilyen degradatív plazmidokat kimutatni

• Ált az aromások bontásában a lehetséges reakciók száma limitált, hidroxiláció, oxigenolitkus gyűrűhasítás, izomerizáció, hidrolizis jell

• Az enzimek indukálható természete, és szubsztrát specifitásuknak köszönhetően a baktériumok nagy degradációs potenciállal rendelk

aromások oxidációja

(8)

Központi intermedierek

hidroxiláció

(9)

gyűrűhasítás

(10)

kometabolizmus

• Egy vegyület transzformációja, melyből a sejtnek tápanyag haszna nincs, a reakció a szaporodási szubsztrát jelenlétében működik. Ekkor a vegyület kémiailag módosul

• A mikroorg szaporodik a megfelelő szubsztráton, és ‘ok

nélkül’ oxidálja a kérdéses vegyületet (koszubsztrát), melyet nem hasznosít, viszont más mikrobák számára tápanyagként szolgálhat

• A reakció előfeltétele, hogy a szaporodó sejt termelje a megfelelő enzimet és kofaktorokat (pl. oxigenázok és elektrondonorjaik)

• Példák: metanotrófok TCE oxidációja a metán-monooxigenáz enzim segítségével, klór-aromások oxidációja

(11)

TCE bontása metanotróf baktériumban:

C C Cl

Cl H

Cl

O C

H Cl C

Cl

TCE

TCE epoxid

Növekedési szubsztrát CH₄

CH₄

CH₃OH

Köztes metabolizmus

szaporodás

NADH

NAD⁺ O₂

H₂O Metán- monooxigenáz

távozik a sejtből (nem stabil)

koszubsztrát

(12)

Forrás: R. L. Brigmon: Methanotrophic Bacteria: Use in Bioremediation Westinghouse Savannah River Company, Aiken, SC 29808

(13)

+

Fenol szubsztrát

4 Cl-fenol koszubsztrát

Forrás: G. A. Hill1, B. J. Milne1 and P. A. Nawrocki1: Cometabolic degradation of 4-chlorophenol by Alcaligenes eutrophus Applied Microbiology and Biotechnology Volume 46, Number 2 / September, 1996

(14)

• Aerob lebontási folyamatokban a központi szerepet az oxigenázok játszák

• Alkánok, aromás vegyületek oxidációját katalizálják, melynek eredménye alkoholok (melyek tovább-

alakulnak aldehidek, epoxidok, karboxilsavak keletk)

• Ipari biotechnológiai jelentőség

(15)

1955 Osamuri Hayaishi - felfedezi az oxigenáz enzimeket dioxigenázok H. S. Mason - felfedezi a fenoláz enzimet monooxigenázok 1965- Irwin Gunsalus - citokróm P450 bakt. monoox.

1970 David Gibson - aromás szénhidrogén dioxigenázok - lebontó útvonalak tanulmányozása

1980- sok kutatócsoport - lebontási útvonalak feltérképezése

Ananda Chakrabarty - katabolikus plazmid transzfer Pseudomonas törzsek között

Oxigenázok

(16)

• Aerob mikroorganizmusokban gyakori, de eukarióta szervezetekben is (pl Citokróm P450)

• Működésükhöz molekuláris oxigénre és kofaktorokra szükség van

• Szerkezetükben, működésükben, kofaktor igényükben a különböző oxigenázok eltérhetnek egymástól

• Általában több alegységesek, fémet is tartalmaznak, melynek szerepe a dioxigén aktiválásában van. Főleg vasat, de van

mangán, réz, kobalt tart-ú is

• A katalizált reakció energianyerő, a felszabaduló erg a szubsztrát szerkezetének destabilizálására fordítják

• Iparilag hasznosíthatóak, genetikailag módosított enzimekkel jobb hatékonyság, szélesebb szubsztrátspektrum hozható létre

Oxigenázok

(17)

Az aromás gyűrű szerkezet lebontási útvonalában a Prokarióta és Eukarióta oxigenázok katalizálta reakciók

első lépcsője

(18)

• Eredetüket tekintve sokszor nagyon eltérő szervezetekből származnak, mégis lehetnek nagyon hasonlóak felépítésüket, szekvenciájukat, specifitásukat tekintve, vagy nagyon eltérőek is lehetnek

• Hatékonyságuk összefüggésben szubsztrátspecifitásukkal

• Gyakran plazmidon kódoltak

• Két nagy csoportra oszthatók:

– Monooxigenázok – Dioxigenázok

Oxigenázok

(19)

I. Monooxigenázok

• Azokat az oxigenázokat, melyek a dioxigén egyik atomjának a szubsztrátba beépülését katalizálják monooxigenázoknak nev. Az oxigén molekula másik atomja redukálódik és vízmolekulává alakul, melyhez elektrondonorként NAD(P)H-t igényel, vagy magát a

szubsztrátot használja

• Többségük egykomponensű enzim, de előfordul multikomponensű is pl. fenol-, toluol monooxigenáz

Csoportosításuk:

1. aromás gyűrű monooxigenázok (fenol 2-hidroxilázok, flavoprotein monooxigenázok)

2. alkil csoport hidroxilázok (alkán hidroxilázok, metán monooxigenáz)

3. citokróm P-450 család

– Multikomponensű enzimkomplex: egy terminális hidroxiláz és egy v több elektrontranszport komponens (főleg emlősökben)

4. aromás aminosav hidroxilázok (Eukariótákban pl triptofán hidroxiláz)

(20)

II. Dioxigenázok

• A dioxigenázok az O₂ mindkét atomját a szubsztrát(ok)ba építik.

Csoportosításuk:

1. Az aromás gyűrűre oxigént építő

- mindig orto pozícióban dihidroxilálnak, katekol származék keletkezik

- funkcionálisan két rész: egy hidroxiláz komponens és egy v több e^- transzport komponens

- A reakcióhoz NAD(P)H-ra is szükség van.

2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok

- A gyűrűt hasító dioxigenázok a gyűrű felnyitását katalizálják, melyhez külső reduktánsra nincs szükség

- 2 v. több –OH csoportot tartalmazó aromás gyűrűk a szubsztrátjaik

(21)

2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok

- Ha a 2 –OH csop. egymáshoz visz. helyzete orto, akkor több pozícióban is hasíthatják a gyűrűt:

megkülönböztetünk 2,3-; 3,4-; 4,5-gyűrű hasító dioxigenázokat:

a, 2,3-; 4,5-dioxigenázok a katekolokat extradiol/meta,

b, 3,4-dioxigenázok intradiol/orto helyzetben hasítják

- Ha a 2 –OH csop. egymáshoz visz. helyzete para pl. gentizát esetén a karboxil csoport és a mellette lévő hidroxil csoport között hasít

II. Dioxigenázok

(22)

Y

R

OH

R

OH

R

OH

R

OH

R

trikarbonsav ciklus

gyûrûhidroxiláló dioxigenáz

4,5-dioxigenáz 3,4-dioxigenáz

2,3-dioxigenáz NADH+H⁺ NAD⁺

O₂ YH

II. Dioxigenázok

(23)

A hasító helytől függően eltérő intermedierek keletkeznek a további átalakítás során

(24)

Gombák degradatív képessége

• A gombák széles körben elterjedtek környezetünkben (talajban, édes-, tengervízben, hulladékban, avarban, állati-, növényi

maradványokon, trágyában, élő szervezetekben)

• Szaprofita, lebontó, szimbionta, parazita

• Fontos degradatív kapacitással és képességekkel rendelkeznek, többek között a veszélyes anyagok elbontásában is szerepet

játszanak

• mikroméretű gombák – élesztők, penészek - és Basidiomyceták

élesztő penész Phanerochaete sp

(25)

Mikroméretű gombák jelentősége a környezetvédelemben

• E csoportot az élesztők és penészek alkotják

• Képesek különféle szervesanyagot lebontani, szén és energia forrásként hasznosítani pl alifás szénhidrogének, aromások

• Legjobban a C_10-20 szénhidrogéneket kedvelik, de oxidálják a hosszabb szénláncokat is, viszont a rövid láncúak toxikusak számukra. Tipikus alkánbontók:

– Élesztők közül példák: Candida lipolytica, Rhodotorula rubra, …

– Penészek közül: Cunninghamella blakesleeana, Aspergillus niger, Penicillium frequentans, …

• Mivel hidrofób vegyületek bontásáról van szó, e gombák is képesek felületaktív anyagot termelni

• Gombákban a lebontási folyamat főleg monooxigenáz enzimkomplex katalizálta terminális oxidációval indul, mely során alkohol keletk a további bontást peroxiszomális enzimek (oxidázok, katalázok) végzik (-oxidáció).

• Képesek hasznosítani az alkéneket is, de az elágazó láncú alkánokat, cikloalkánokat nem szeretik

(26)

• Sok gomba képes hasznosítani aromás vegyületeket is szén és energiaforrásként, de főleg kometabolizmussal alakítják át

• Az aromás gyűrűt orto-hasító útvonalon bontják, amihez szükséges két OH csoport orto helyzetű jelenléte, amit hidroxiláz enzimek

segítségével kapcsol a gyűrűre. Ezek az enzimekNAPH függő monooxigenázok orto és para helyzetben tudnak hidroxilálni. A

felhasadt vegyület továbbalakul és belép a trikarbonsav ciklusba, így biomassza, CO₂ és víz keletkezik. Az elbontandó vegyület felvételét specifikus energia-függő felvételi rendszerrel biztosítja.

• A gyűrűhidroxiláló és gyűrűhasító enzimeik előnye, hogy relatíve nem specifikusak, így többféle vegyületet is támadnak pl. halo-, nitroaromások…

• Kometabolikus reakcióban számos vegyületet képesek átalakítani, pl PAH-ok, bifenilek, dibenzofuránok…

• Degradatív képessük miatt jelentősek a szén-ciklusban, és a talaj öntisztító képességében

Mikroméretű gombák jelentősége a

környezetvédelemben

(27)

• Makroszkópikus méretűek, főleg az avarban, a talaj felső rétegében, erdőkben, legelőkön és lignocellulóz tartalmú

anyagokon találjuk meg őket

• A cellulózt védő lignin

elbontásában óriási szerepük van

Phanerochaete chrysosporium

Basidiomyceta gombák jelentősége a

környezetvédelemben

(28)

Ligninolitikus enzimrendszer

• A lignin a cellulóz mellett a növények anyagainak egyik fő

képviselője, a növény támasztórendszerét erősíti, a rigiditásért felelős

• Gátat jelent a mikrobákkal szemben, megvédi a bontható poliszaharidokat (cellulóz, hemicellulózok)

• Heterogén polimer, fenilpropán egységekből épül fel, melyek sokféle kovalens kötéssel kapcsolódnak egymáshoz

• A kötések típusa és heterogenitása miatt hidrolitikusan nem bontható (ami egyébként a polimerek bontására jellemző)

• A kötés sokféleség miatt igen meglepő, hogy az evolúció során egyes fajok, basidiomyceta gombák képessé váltak e polimer bontására

• a lignint szelektíven bontják, a cellulózt (fehér rostokként látszanak) nem bántják, ezért fehér rothasztó gombáknak is nevezzük őket:

– Fákat támadók: Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus

– Avar rothasztók: Stropharia rugosoannulata, Mycena galopus, Agrocibe praecox

(29)

• Noha a lignin bontható, nem elsődleges szénforrása a gombáknak, szaporodásukhoz a jelenlévő hemicellulózokat hasznosítják

• A lignin bontásban több enzim kooperál: mangán peroxidáz (MnP), lignin peroxidáz (LiP), lakkáz – nem specifikus reakciók. A

peroxidázok működéséhez peroxidra szükség van, a lakkáz O2 –t igényel

• A lakkáz és a LiP az aromás szubsztrátot támadja közvetlen

oxidációval szabad gyököt képez, míg a MnP közvetve hat egy kelált Mn³⁺ ionon keresztül, mint alacsony molekulatömegű redox mediátor (a funkciója Mn²⁺-ből, ami a szubsztrátja az enzimnek Mn³⁺-at képez, mely nagyon reaktív). A MnP-nak szüksége van Mn-keláló ágensre pl. oxalát, malát. A kelált Mn elég kicsi molekula komplex ahhoz, hogy bejusson a lignocellulóz hálóba, és ott reagál a fenolokkal

• A kezdeti enzimtámadás eredménye vízoldékony lignin fragmentek, melyek továbbalakulnak a lignolitikus enzimek segítségével

Ligninolitikus enzimrendszer

(30)

(31)

Three basic monomers of lignin

Manganese Peroxidase

(32)

• A Basidiomyceta gombák lignolitikus enzimrendszere az erős reaktív szabadgyökökkel tört depolimerizációs mechanizmusuk alapján alkalmasak szerves szennyezőanyagok biodegradációjára

• Az extracelluláris, nem specifikus, nem-sztereoszelektív

tulajdonságuk miatt számos toxikus, bontásnak ellenálló vegyület támadására képesek

• Amiért mégsem ezek a legjelentősebb rendszerek a természetben a biodegr során, azért van, mert kompeticiós képességük kicsi. A

korhadást okozó gombák a talajban csak rövid ideig képesek túlélni (csak a fás körny-t szeretik)

• Ennek ellenére bizonyos esetekben csak ezek vethetők be megfelelő körülményeket biztosítva

• Összességében nem mondhatjuk, hogy a baktériumok/ vagy éppen a gombák a jobb lebontók, az adott körülmény határozza meg

melyiket használjuk

Ligninolitikus enzimrendszer

(33)

Anaerob aerob kooperáció

• A szervesanyagok, főleg aromások esetén a funkciós csoportok (pl. halo-, nitro-, szulfo-) számának növekedésével egyre hosszabb ideig lesznek jelen a körny-ben

• Minél inkább elektrofil egy molekula, annál kevésbé támadható elektrofil támadással pl. oxigenázokkal (- aerob mikroorg)

• A természetben is pl halogén tart-ú vegyületek esetén főleg anaerob mikroorg reduktív támadása jellemző, általános a

természetben, legtöbb esetben konzorciumok végzik, de ritka a teljes elbontása az adott vegyületnek, A keletkező termék az aerobok számára is legtöbb esetben már elfogadható, így

mineralizálódik, vagy továbbalakul ezek által