Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek felületi rögzítése hordozónpolimerekbe zárásakeresztkötése IMMOBILIZÁLÁS

IMMOBILIZÁLÁS

Mikroorganizmusok, sejtek, enzimek felületi rögzítése hordozón

polimerekbe zárása

keresztkötése

Immobilizáció

• a sejtek kötődésének vagy bezárásának különböző formáit összefoglaló fogalom

• A természetben gyakran találkozunk vele

- legtöbb sejt életciklusa bizonyos fázisában igyekszik helyhez kötődni

• Élő sejtek polimer gélbe zárását először 1969-ben Updike és mtsai írták le

• Tudományos és ipari jelentőség: pl. aminosavak, szerves savak, antibiotikumok, szteroidok, enzimek előállítása

• Környezeti alkalmazásuk is egyre jobban terjed

Előnyök

• Védjük a rögzített sejteket a külső behatásoktól, valamint megakadályozzuk eltávozásukat a reakciótérből

• Állati és növényi sejteket, szöveteket is lehet immobilizálni

• Számos biokatalitikus rendszer számára előnyös

• Javul a metabolikus aktivitása a sejteknek

• Plazmid stabilitás nő

• Kisebb a fertőzés veszélye

• könnyebben tárolható Hátrányok

• A szaporodó sejtek kiszabadulhatnak az immobilizáló anyagból, ha szétfeszítik azt

• A diffúziós barrier a mátrix, vagy a nagy sejtsűrűség miatt növekedhet

• Aerob rdsz-knél az oxigénhez gátolt lehet a hozzáférés

Milyen paramétereknek kell megfelelnie egy jó hordozónak:

• Nem-toxikus

• Nem szennyező

• Jó minőségű, hosszú élettartam

• Biztosított legyen a sejtaktivitás és denzitás

• Biztosított legyen a sejtek kijutása a célhelyre (ha szükséges) Hordozók

• Természetes és szintetikus polimerek:

agar, agaróz, poliakrilamid

alginát, karragenan, polisztirén

cellulóz, kollagén, stb poliuretán

•

• Egyéb:

üveg, kerámia, agyag, apatit, alginit,

ioncserélő gyanták

Immobilizálási stratégiák

1. felületi adszorpció

2. bezárás a: encapsulation b: entrapment 3. keresztkötés

4. biofilm képzés

5. aggregátum képzés, flokkuláció

6. hordozóhoz kötés (ionos, kovalens)

1.

2. a, b,

3.

4., 5.

6.

A sejtek a szilárd felszínhez egy/több fehérjén keresztül kapcsolódnak

Lpp = lipoprotein

OmpA = outer membrane protein A

AmCyan = cyan-fluorescent protein

Alginát

• Barna algából nyerik

• Lineáris poliszaharid, -D-mannuronát (M) és -L-guluronát (G), 1 4 kötések

• Homopolimer blokkok (G-, M-blokk) ill és vegyes blokkok (GM blokk) random

szerveződnek (az alginát eredetétől függően egyedi szerkezet/felépítés)

• G-blokk divalens kationokkal (Ca²⁺, Ba²⁺, stb) stabil keresztkötéseket hoz létre, ennek köszönhető, hogy immobilizáláshoz

használni tudjuk

• Több G-blokk esetén erősebb, rigidebb gélt kapunk és kisebb porusméreteket, több M- blokk esetén lágyabb a gél és nagyobb porusméreteket találunk

• A gélesedés nem hőmérséklet függő

Keresztkötött G frakciót jelöli

Gélesedési zóna

M frakciót jelképezi

Alginát gélágy kialakítása

Idegen mikróbák

tápanyagok Alginát burok Metabolitok, anyagcsere termékek

sejtszuszpenzió Alginát oldat

CaCl₂ oldat

sejtek

Egyszerű, sejt- és környezetbarát módszer

karrageenan

• Vörös algák termelik

• 3 típus: -, -, -karrageenan

• Nagyon sokféle forma, de az alapváz közös: (1,3)-D-galaktóz és (1,4)- D-galaktóz molekulák váltják

egymást, viszont eltérnek abban, hogy a két cukor hol szulfonált és mennyi szulfoncsoportot tartalmaz

• A gélesedés hőmérséklet függő folyamat, K⁺ ionok jelenlétében

• Hátránya, hogy a gélesedéshez legalább 40°C szükséges, mely az immobilizálandó mikrobák

többségének kedvezőtlen ^hűtés

melegítés

Gelrite

• Természetes anionos poliszaharid, glükuronsav, rhamnóz és glükóz alegységekből épül fel

• rigid, agarszerű gélt képez elsősorban kétértékű kationok jelenlétében

• hőstabil

n

O O

O O

CH₂OH

OH OH

OH

OH

COOH

CH₂OH

OH

OH

OH OH

CH₃

O

O

O

O OH O

• Kationos polimer, D-glükóz- amin egységekből épül fel

• Legtöbb savban, főleg szerves savakban oldható

• Nem toxikus, lebontható

• Kozmetikai, orvosi,

élelmiszeripari jelentősége is van

Kitozán

ciklodextrin

• A ciklodextrin keményítőből előállítható, belül üreges, henger alakú molekula, amelybe, mint egy kapszulába, bezárhatók más anyagok

molekulái.

• A keményítőben a kötéseket  térállású OH-

csoportok hozzák létre, minden kötés ugyanolyan irányba fordul, ezért a keményítő molekulája úgy csavarodik, mint egy spirálrugó, vagyis

hélixszerkezetű.

• A Bacillus macerans (és néhány egyéb mikro- organizmus) által termelt enzim ezt a hélix szer- kezetet úgy hasítja el egyszerre két helyen, hogy egyúttal össze is zárja a keletkező két szabad vég- csoportot, s így alakul ki a ciklodextrin-szerkezet.

• E molekuláris „csomagolóanyag” lehetővé teszi, hogy új, a meglevőknél hatékonyabb

gyógyszereket gyártsunk.

• környezeti alkalmazhatósága is bizonyított, mivel immobilizálja a szennyeződéseket, vagy akár a remediációhoz használandó mikrobákat

alfa-ciklodextrin (a hidrogénatomokat zöld, az oxigént piros, a szenet szürke színű gömbök

jelölik)

Poliakrilamid

• Az akrilamid gyökképző

(ammónium perszulfát) hatására lineáris polimert képez, s ezt a polimerizációs folyamatot

katalizátorral (TEMED) lehet gyorsítani. A térhálós polimer

szerkezet kialakítása bis-akrilamid alkalmazásával oldható meg. Ilyen térhálós szerkezet nemcsak

makromolekulák, fehérjék, nukleinsavak elválasztását, de immobilizálását is lehetővé teszi.

kaolin agyag polyacrylamide ‘híddal’ metastabil szerkezetet hoz

Polisztirol

• Polisztirollal mindenhol találkozunk környezetünkben

• A polisztirol a sztirol polimerizációs

terméke, policiklusos aromás szénhidrogén.

• a sztirol a kőolaj feldolgozás egyik mellék- terméke, normál hőmérsékleten meg-

lehetősen állandó (az Egészségügyi Világ- szervezet (WHO) szabványa szerint azonban mérgező, és rákkeltőként is figyelembe kell venni). Könnyen polimerizálódik

• A polisztirol ellenáll a savaknak, lúgoknak, de a legtöbb szerves oldószer megtámadja, és érzékeny a fényre is.

• Az 1930-as évektől használják intenzíven, először szintetikus gumit állítottak elő belőle

Poliuretán

• A poliuretán (PUR) csaknem korlátlan lehetőségekkel bíró termoplasztikus műanyag. Régóta alkotóeleme mindennapi életünknek. Két, speciális

receptúra szerint előállított komponensből (A - poliol, B - izocianát) áll, melyből az adalékok mennyisége és minősége, valamint a komponensek keverési aránya alapján kemény, félkemény és lágy habanyagok,

öntőmasszák, lágy vagy kemény elasztomerek gyárthatók a legkülönbözőbb felhasználási célokra.

A B

Bioremediációs alkalmazások

• Fontos szempontok: produktivitás

stabilitás az alkalmazás során stabilitás a tárolás során

érzékenység a szennyezőanyagokra egyszerű/összetett

biztonság

előnyök/hátrányok

• Szennyvíz tisztítás, talaj remediáció, biofilm, bioreaktorok,

Biodegradáció immobilizált sejtekkel és enzimekkel példák

1. Szerves-foszfát peszticidek bontása:

Pseudomonas diminuta - foszfotriészteráz enzim széles szubsztrát specifitás

paraoxon hidrolizis:

immobilizálás: (porózus szilikagélre), tritil agaróz

egyszerű eljárás fix-ágyas csőreaktor

O NO₂

O P O

O

OH O P

O

O

O

H NO₂

CH₃CH₂ CH₃CH₂

H₂O

CH₃CH₂

CH₃CH₂ +

szubsztrát

pumpa

bioreaktor

detektor

gyűjtőtartály

UV/VIS

2. Herbicidek bontására példa:

glifozát széles spektrumú herbicid, előszeretettel alkalmazzák

(Monsanto szennyvízkezelés szükségessé vált) pilot plant: kovaföldre immobilizált mikroba konzorcium

H₂SO₄ Szennyvíz

tározótó b

i o r e a k t o r Tápanyag

tank levegő

Kiegyenlítő tank

3. Fenolos hulladékok bontása

Fusarium flocciferum

poliuretán + felületaktív anyag

1 g/L fenol koncentráció mellett négy hónap alatt teljesen elbontja

4. Pentaklórfenol bontása

Arthrobacter sp.

koimmobilizált rendszer: a baktériumot aktív szénre rögzíti, majd alginát oldatba adagolja (egyéb hordozókat is vizsgáltak)

gélmembrán

A kapszula belsejében Az adszorbens és a sejtek levegő

CO₂ csapda elhasznált

levegő

Fontos paraméterek: az adszorbens mennyisége, az alginát gél porozitása,

segíti a PCP adszorbciót és mineralizációt felületaktív anyag jelenléte

PCP bontása Arthrobacter-rel

Alginát gélbe zárt, CP bontásban élenjáró baktériumok összehasonlítása

baktériumok: Pseudomonas putida, Pseudomonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter

1. 10 mg/L CP – free c.

2. 50 mg/L CP – free c.

3. 10 mg/L CP – imm. c.

4. 50 mg/L CP – imm. c.

3 4

2 1

1. 5 mg/L CP – free c.

2. 10 mg/L CP – free c.

3. 50 mg/L CP – free c.

4. 5 mg/L CP – imm. c.

5. 10 mg/L CP – imm. c.

6. 50 mg/L CP – imm. c.

3

1 2 6

4 5

1. 5 mg/L CP – free c.

2. 50 mg/L CP – free c.

3. 5 mg/L CP – imm. c.

4. 50 mg/L CP – imm. c.

12 4 3

5. Fenol bontás kevert kultúrával

üveglapra kolloid szilika oldatba kevert mikroorganizmusok rögzítése, a rögzült rétegre újabb szilika réteget visznek.

6. p-nitrofenol (PNP) bontása

peszticid és gyógyszergyártásban fordul elő

Pseudomonas sp. 8 törzs együttesen (P. putida, P. fluorescens, P. mendonica) Kovaföld hordozó, oszlop bioreaktor, levegőztetett

a rögzített sejtek képesek tolerálni az 1800 mg/L PNP konc. is!

7. Poliklórozott bifenilek bontása

két Pseudomonas faj és egy Alcaligenes faj ko-kultúrában bont kevert PCB-t, három féle hordozón

8. Morfolin bontás Mycobacterium aurum-mal (G+ baktérium)

morfolin = 1,4 – tetrahidro – oxazin (heterociklusos vegyület: C4H9NO) származékai: adalékanyagok, oldószerek,

antioxidáns anyagok, stb.

gyártásuk során az effluensben morfolin jelenik meg, ezért fontos lebontásának kidolgozása

9. Nikkel - ötvözet szálakon létrehozott Thiobacillus ferrooxidans biofilm vas-szulfát oxidációja

- acidofil, aerob kemolitotróf baktérium

- extrém alacsony pH (< 2,0) a vas(III)szulfát kicsapódásának elkerülése érdekében - a baktérium igyekszik hozzátapadni szilárd felszínhez, így nem könnyen mosódik ki

10. Higany biotranszformáció fluid-ágyas bioreaktorban

- különösen a szerves higany vegyületek veszélyesek, bár ipari és mezőgazdasági

felhasználása ma már korlátozott, de tartósan ott maradt a környezetben,

- ivóvízben < 1μg/L a max. megengedett konc.

- mikrobiálisan az oxidációs állapot változtatható, illetve a szerves higany vegyületek átalakíthatók (az elemi higany kevésbé toxikus)

- pl. Aeromonas hydrophilia – kofaktor függő higany reduktáz rendszere

- szilika és aluminium porózus

hordozóra rögzítve, de több probléma is volt, pl. az elemi higany akkumulálódott, nem távozott el. Levegőztetéssel némileg javult, és a gőztérből kihajtották a Hg-t, melyet kondenzáltak, majd reciklizálták

- a problémák kiküszöbölésére új rendszer - Pseudomonas putida KT2442, random mutagenezissel létrehoztak egy Hg(II)

redukáló törzset (első próba polivinil alkohol hidrogélbe)

- alginát gélbe ágyazott sejtekkel igen jó eredmények folyamatos rendszerben

11. Kadmium eltávolítása bioszorbens segítségével

- abból indultak ki, hogy a poliszaharidok kötődnek fémekhez

ezt a tulajdonságot fordították meg, kadmiumot a cukor polimerhez alginát, mint szorbens megfelelő volt air-lift reaktorban kivitelezve - a telítődött szorbensből megfelelő eljárással kivonható a kadmium

Flow rate: 2 dm³/min Flow rate: 4 dm³/min

Kevesebb belépő kadmium esetén a szorpció

hatékonyabb Emelt szorbens koncentráció mellett szintén kevesebb

az effluens kadmium tartalma A szorbens porozitása szintén befolyásolja a kötődés hatékonyságát

12. Felületaktív anyag bontása alginát/pektát gélbe immobilizilált Comamonas terrigena baktériummal

- vegyipar, gyógyszeripar, élelmiszeripar használja

- negatívan hat a mikrobiális életre, mivel megbontja a membrán stabilitását, habzik befolyásolva az oxigén diffúziót

(bizonyos esetekben előnyös a jelenlétük olajbontás)

- gélágyba immobilizálva a sejteket megvédjük a káros hatásoktól konkrét példa: anion aktív anyag – dihexilszulfoszukcinát (DHSS) alginát/pektát kevert gélágyban Comamonas terrigena