Mikroorganizmusok - 1 Biotechnológia

Biotechnológia

Mikroorganizmusok - 1

Metanogének:metánt termelnek

• Volta 1776:

mocsárgáz = CH₄ + CO₂

• Tiszta tenyészet 1947

– Methanosarcina sp.

Metanogének

• Ma: élet a Marson?

– Metán a légkörben

– Felszín alatti vizekben?

– Vosztok tó

Metanogének

• Obligát anaerobok

• Archaea

– Legősibb életforma

– Extremofil: termofil, pszichrofil, alkalofil, acidofil – Kérődzők, termesz, bálna

Archaea

• Tenyésztés

– Obligát anaerobok

– Kemolitotrófok, heterotrófok – Ni²⁺ kell, cukor nem

– 15-110 °C

• Felépítésük – Sejtfal

• Murein nincs,

• Helyette: pszeudomurein

Fehérje és pszeudomurein

murein=peptidoglükán

Lipid membrán

Archaea

• Felépítésük

– Sejtfal

• Murein (peptidoglükán) nincs, pszeudomurein

– N-acetil-glükózamin,

– N-acetil-tallózaminuronsav

Archaea

• Felépítésük

– Sejtmembrán

• Zsírsav észterek helyett diéterek, tetraéterek

• Sztereoizomer foszfolipidek

• Zsírsav láncok helyett izoprén láncok

– Koenzimek

• F42o – riboflavin

• F43o – Ni-tetrapirol

• metanofurán

Archaea

• Energia nyerés O₂ nélkül

– Kén oxidálók

CO₂ + H₂S

→

CH₃COOH

→

→

Archaea

• Molekuláris biológia (≈ bacteria + eukarióta)

– Policisztronos transzkripció – Start/stop: AT gazdag

– TATA box: -25 bp

– DNS polimeráz, RNS polimeráz: ≈ eukarióta

– Riboszóma: 30S+50S=70S

≈ eukarióta

Archaea

• Első genom szekvencia (1996)

– Methanococcus jannaschii (1,5 Mbp)

Metanogének

• Biotechnológia

– Biogáz:

• Tehén: 200 liter/nap

• Ember: 2-3 liter/nap

– Mezőgazdasági hulladékok

– Szennyvíziszap

– Kommunális hulladék – Energianövény

METANOGENEZIS

HIDROLIZÁLÓ MIKROORGANIZMUSOK

Polimerek bontása:

Poliszacharidok (cellulóz, keményítő), fehérjék, zsírok

Monomerek, oligomerek emésztése:

Cukrok, aminosavak, zsírsavak

ACETOGÉN MIKROORGANIZMUSOK Illékony zsírsavak +

H

METANOGÉNEK

CH₄ + CO₂

Alapelv

Anaerob fermentáció Szerves

anyag,

“hulladék”

BIOGÁZ

TÁPANYAG

Aerob vs. Anaerob fermentáció

KOI mérleg biogáz

KOI

iszap

KOI mérleg komposztálás

KOI

iszap

hő

KOI = kémiai oxigén igény = lebontható szerves anyag

Biotechnológiai kihívás

Tehén: 2-3 nap

Mezofil: 30-60 nap

Termofil: 15-30 nap

Batch fermentáció (1 lit)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

napok

biogáz termelés (l)

beoltott kontroll

Biogáz intenzifikálás

Biogáz termelés mérése

Folyamatos üzemű 5 liter

Biogáz termelés mérése

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Gáz termelés

Hónapok

Biogáz termelés sertés hígtrágyából

Beoltás

Félüzemi kísérlet

BIOGÁZ üzemi kísérletek

Hulladék Térfogat (m³)

Biogáz növekmény (%)

Tehén trágya 0,01 180

Sertés hígtrágya 0,01 250

Sertés hígtrágya 1 220

Sertés hígtrágya 15 200

Sertés hígtrágya 250 220

Sertés hígtrágya 10 000 180

Háztartási szilárd 300 140

Szennyvíziszap 0.01 170

Szennyvíziszap 2 500 160

Zöldforrás Energia Kft

Zöldforrás Energia Kft

Zöldforrás Energia Kft

Metagenomika

Metagenomika

Fontosabb paraméterek:

•Leolvasási hossz: 35-50 bp

•Áteresztőképesség: 50 Gb/lemez/futás (10 000 x 5 Mb baktérium genom)

•Nagy pontosság: homopolimer nem zavar, ligálási reakció

SOLiD V4, SOLiD 5500XL

Fontosabb paraméterek:

•Leolvasási hossz: 200-300 bp

•Áteresztőképesség: 200 Mb- 2Gb/futás

•Nagy pontosság: polimeráz reakció

Ion Torrent Personal Genetic Machine

Különleges alapanyagok

•

•

Kazein Vér

Mikroba közösség szerkezete indításkor

Alkalmazkodás a megváltozott szubsztráthoz

Vér az adaptálás kezdetekor Vér 5 hét adaptálás után

Mikroba közösség változása adaptáláskor

A legnagyobb gyakorisággal előfordulók

Algák

Algák

Algák

Silokukorica

Silokukorica – alga keverék

Alga

Helyünk az EU-ban: 2009

Nemzeti Cselekvési Terv 2011

Helyünk az EU-ban: 2020

EU villamos energia termelés biogázból

Metilotrófok

• Aerob baktériumok, zömmel Gram negatív

• Sokfélék

– Fakultatív metilotrófok: preferáltan C1-C3, de magasabb C-t is metabolizál

– Obligát metilotrófok: csak C1-C3 – Metanotrófok: csak CH₄

Metanotrófok

• Természetben: aerob/anaerob határon

• Anyagcsere: metán oxidáció

CH₄

sMMO

pMMO

CH₃OH NADH+H ⁺ NAD⁺

O₂ H₂O

O₂ H₂O

HCOH

X XH₂

CytC_ox CytC_red MDH

FADH

FDH

HCOOH CO₂

NAD⁺ NADH+H ⁺

Metilén-H₄MPT

Metenil-H₄MPT Formil-H₄MPT Formil-MFR H₄MPT útvonal

Szerin útvonal

Metilén-THF

Metenil-THF

Formil-THF THF útvonal

RuMP útvonal

H₄MPT

'mm oQ_folát

NADH+H ⁺ NAD⁺

Metanotrófok a környezetben

O₂

CH₄

Üledék

CH

Metanogének

CO

Víz Aerob / Anaerob

határfelület

CO

CH

Metán oxidáció

Metanotrófok

• Kulcsenzim: metán monooxigenáz = MMO

– szolubilis (sMMO) vagy membrán kötött (pMMO)

– sMMO: sok szubsztrát kofermentációval

– pMMO: csak CH₄

CH₄

NADH+

H⁺

O₂

H₂O

NAD⁺

O₂

H₂O

X_ox X_red pMMO sMMO

CH₃OH

sMMO szubsztrátjai

Vegyület Tiszta tenyészet által produkált termék

klórmetán formaldehid

di-klórmetán szénmonoxid

tri-klórmetán (kloroform) széndioxid

brómmetán formaldehid

benzol fenol és hidrokinon

Toluol p -krezol, benzil-alkohol, benzoesav

stirén sztirénoxid és hidrosztirén

m-krezol hidroxibenzaldehid

o-krezol 5-metil-1,3-benzoldiol

m-klorotoluol benzil-alkoholok

Naftalin naftolok

1- and 2- metilnaftalin NK

vinilklorid NK

1,2 & 1,1-diklóretilén NK

trikklóretilén diklórecetsav és TCE-diol (széndioxid)

1,1- & 1,2-diklóretán NK

1,1,1- & 1,1,2-triklóretán NK

NK= Nem Kimutatható

Metanotrófok

• MMO bioszintézist [Cu

] szabályozza

– Kevés Cu²⁺ → sMMO – Sok Cu²⁺ → pMMO

A metanobaktin szerkezete.

Cu⁺

MMOC

MMOA MMOB











reguláció

+ H ⁺

sMMO

pMMO

Azonos reakció különböző

enzimekkel

Metán anyagcsere

CH₄ ^CH₃^OH

NADH+H+ NAD+

HCOOH CO₂

MDH

RuMP útvonal

Szerin útvonal Type II Metanotrófok Type I Metanotrófok

FADH FDH

pMMO

H₂CO

X red X ox NADH+H+ NAD+

sMMO

O 2O 2 H 2OH 2O

Metanotróf: oxidációs lépések

• Metanol oxidáció

– MeOH dehidrogenáz (pirolloquinolin quinon) – Alkohol dehidrogenáz (NADPH⁺, Zn²⁺, Mg²⁺)

• Formaldehid oxidáció

– Elágazás biomassza termeléshez

• Szerin vagy ribulóz-P útvonalon

• Hangyasav oxidáció

– NAD dehidrogenáz (koenzim regenerálás)

Metilotróf biotechnológia

• Bioremediáció

– Halogénezett veszélyes szennyeződések

– Kofermentációval

• Szerves anyagok

termeltetése

Metilotróf biotechnológia

• Bioremediáció

• Szerves anyagok termeltetése

– Egyszerű szubsztrát = olcsó, szelekciós nyomás – Aminosavak, single cell

protein – Metanol

Vegyipari metanol szintézis

50-100 atm

230-280 ^oC

1- 25

700-900 atm ^oC

CH₄+H₂O   ^CO+H₂   ^CH₃^OH

metanotróf baktériumok CH₄+H₂ +O2 

Biológiai alternativa

Atmoszférikus nyomás (1 atm)

25-70 ^oC

 ^CH₃^{OH + H}₂^O

Clostridia

•

•

•

•

•

•

•

•

Clostridia

• Obligát anaerobok

• Gram pozitívok

• Hőstabil endospóra

– Ellenálló – Túlélő

Clostridia

• Tenyésztés

– Obligát anaerob

– Oxigén gyökök ellen:

szuperoxid dizmutáz (SOD), kataláz

– E_h ≈ -15o - -45o mV

– Anaerob tenyésztés nehéz, spóra tárolható

Clostridia:anyagcsere

• Poliszacharidok

– Celluláz: celluloszóma – Amiláz

Clostridia:anyagcsere

• Mono- és diszacharidok

– Embden-Meyerhof-Parnas – Szolventogenezis

• Gázok

– H₂ + CO₂ – N₂ fixálás

C. botulinum

• Botulin toxin

– Acetilkolin

felszabadulást gátol – Biofegyver

• de gyorsan inaktiválódik

• Irak: 19ooo liter = 3x az egész emberiség kiírtási dózisa

– Gyógyászat

C. botulinum

• Botulin toxin

– Acetilkolin

felszabadulást gátol – Biofegyver

– Gyógyászat

• Élelmiszer mérgezés (kolbász, sonka, méz!)

• Izomrángás

• Ránctalanítás

C. tetani

• Tetanospazmin

– Proteolitikus toxin – Mozgató

idegvégződésekben – Glicin, GABA gátló

neurotranszmitter – Paralízist okoz

– Érzékszervek nem sérülnek

Clostridia: biotechnológia

• Kis molekulák

– butanol, etanol, i-propanol – Hátrány

• Kevert termékek

• Oldószer tolerancia

– Biobutanol

• Jobb, mint bioEtOH:

– Energiatartalom – Vízmegkötés

– Szállítás, párolgás

– Ca-Mg-acetát = zöld só

Clostridia: biotechnológia

• Oldószer gyártás

– C. acetobutylicum

• Enzim gyártás

– Amiláz, celluláz

• Neuropeptidek

– Botulin,Tetanospazmin

• Bioenergia

– H₂ + CO₂, biogáz, biobutanol

Tejsav baktériumok (LAB)

• Pasteur (1857), Lister (1873)

• Emlősök minden testnyílásában

– apatogének, patogének

• Spontán élelmiszer fermentáció

– Tej, zöldségek

Tejsav baktériumok (LAB)

• Spontán élelmiszer fermentáció

– Bakteriocin

– Élő kultúrák – probiotikum pl. Bifidus essensis =

B. digestivum = B. regularis = Lactobacillus bifidus

Tejsav baktériumok (LAB)

• Gram pozitív

• Anaerob

• Nincs spóra

• Tejsavat fermentál fő termékként

• Sokféle környezetben előfordul

Gram negatív Gram pozitív

Tejsav baktériumok (LAB)

• Molekuláris biológia

– Plazmidok

– Génbeviteli eljárások (konjugáció, transzdukció, protoplaszt fúzió,

elektroporálás) megoldottak – Teljes genom szekvenciák

– Genetikailag módosított LAB-ok

Tejsav baktériumok (LAB)

• Anyagcsere

– homo- és

heterofermentatív

• Oxigén detoxifikálás

– széles választék

• Belső pH szabályzás

Tejsav baktériumok (LAB)

• Anyagcsere

– Zamatanyagok

• Silózás

– Zöld takarmány tartósítás

– Biogáz termelés

Tejsav baktériumok (LAB)

• Élelmiszer tartósítás

– Pickling: LAB + Só

• Hal, zöldségek – kimchi

• Tojás, kigyó

Tejsav baktériumok (LAB)

• Élelmiszer tartósítás

– Kancatejből

• kumisz

– Tehén-, juh-, kecsketejből

• joghurt, kefír

• sajtok

– Növényi alapanyagokból

• Szójaszósz

• Savanyú káposzta

• Kovászos uborka