A kalciumpermeábilis humán P2X4

Teljes szövegt

(1)DOI:10.14753/SE.2015.1718. A kalciumpermeábilis humán P2X4 és TRPV6 ioncsatornák működése és gátlása Doktori értekezés. Balázs Bernadett Éva Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola. Témavezető: Dr. Zsembery Ákos egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Zelles Tibor egyetemi docens, Ph.D. Dr. Szentesi Péter tudományos főmunkatárs, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:. Dr. Tretter László egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Riba Pál egyetemi docens, Ph.D. Dr. Fodor János, Ph.D.. Budapest 2014.

(2) DOI:10.14753/SE.2015.1718.

(3) DOI:10.14753/SE.2015.1718. Tartalomjegyzék I. Rövidítések jegyzéke………………………………………………………….. 5 II. Bevezetés……………………………………………………………………… 8 II. 1. Az ioncsatornák…………………....................................................... 8 II. 2. Az ATP mint extracelluláris szignálmolekula……………………… 10 II. 3. Az intracelluláris kalcium-homeosztázis…………………………… 11 II. 4. A purinoceptorok…………………………………………………….13 II. 4. 1. P2Y metabotróp receptorok……………………………… 15 II. 4. 2. P2X ionotróp receptorok…………………………………. 15 II. 4. 2. 1. A P2X4 purinerg receptor……………………… 16 II. 5. A TRP fehérjék……………………………………………….……...18 II. 5. 1. TRPV6 csatornák………………………………………… 18 III. Célkitűzések……………………………….………………………….……... 21 IV. Módszerek…………………………………………………………………… 22 IV. 1. Sejttenyésztés……………………………………………………… 22 IV. 2. Konstrukt-készítés…………………………………………………. 22 IV. 2. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 készítése………………………. 22 IV. 2. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 készítése…………………….. 22 IV. 3. Tranziens transzfekció………………………………………..…… 23 IV. 3. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 transzfekciója…………………. 23 IV. 3. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 transzfekciója……………….. 23 IV. 4. Sejtklónok létrehozása…………………………………………….. 23. 1.

(4) DOI:10.14753/SE.2015.1718. IV. 5. Sejtfelszíni biotiniláció és western blot…………………………… 24 IV. 6. Immunofluoreszcencia……………………………………………... 25 IV. 7. Intracelluláris [Ca2+] mérés..….………………………………........ 25 IV. 7. 1. Az egyes sejtek szintjén történő kalciummérés………… 25 IV. 7. 2. Fluoreszcens intracelluláris [Ca2+] mérés……….............. 26 IV. 7. 3. FLIPR Tetra módszer…………………………………….27 IV. 8. A Ca2+-belépés vizsgálata mangán „quench” módszer alkalmazásával…………………………………………………………….. 27 IV. 9. Elektrofiziológia……………………………………………………. 28 IV. 10. Statisztika…………………………………………………………. 28 V. Eredmények………………………………………………………..…………. 30 V. 1. A transzfektált hP2X4 receptorok lokalizációja HEK-293 sejtekben………………………………………………………………….. 30 V. 2. A hP2X4 fehérjék plazmamembránon expresszálódnak……………. 31 V. 3. A hP2X4 receptorok kationpermeábilis ioncsatornaként működnek. 31 V. 4. Az ATP-indukált intracelluláris Ca2+ koncentráció mérése a hP2X4 receptorokat stabilan expresszáló sejtekben……………………………… 33 V. 5. Az 5-BDBD gátolja az ATP-által indukált Ca2+ jeleket a hP2X4 receptorokat stabilan expresszáló sejtekben ……………………………... 37 V. 6. Egyes sejtek szintjén történő [Ca2+] mérés a tranziensen expresszált hP2X4 receptorokon…………………………………………...38 V. 6. 1. Az [Ca2+]i -ban bekövetkező ATP-indukált koncentrációfüggő változás a humán P2X4 receptort expresszáló és nem-expresszáló sejtekben………..…………………..……….. 38. 2.

(5) DOI:10.14753/SE.2015.1718. V. 6. 2. Az ATP indukált [Ca2+]i változás vizsgálata kalciumot tartalmazó és kalcium mentes oldatban, valamint ivermektin jelenlétében……………………………………………………….. 40 V. 6. 3. Az 5-BDBD és a TNP-ATP dózis-függő gátlása a hP2X4 receptorokat tranziensen expresszáló sejtekben…………………... 42 V. 7. Az 5-BDBD koncentráció-függő gátlásának vizsgálata a hP2X4 receptorokon elektrofiziológiai módszerekkel……………………………. 43 V. 8. Az 5-BDBD kompetitíven gátolja a hP2X4 receptor csatornákat…... 44 V. 9. A hTRPV6 plazmamembrán expressziója HEK-293 sejtekben……. 45 V. 10. A hTRPV6 működése és gátlása…………………………………... 46 V. 10. 1. A hTRPV6 kalciumpermeábilis ioncsatorna…………... 46 V. 10. 2. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornákon keresztüli Ca2+ beáramlást …………………………………………………... 47 V. 10. 3. A 2-APB gátolja a hTRPV6 csatornán keresztüli Mn2+ transzportot …….…………….……………………………………49 V.11. A hTRPV6 fehérjék citoszól és membrán frakciójának elkülönítése HEK-293 sejtekben……………………………………………………..... 51 VI. Megbeszélés……………………………………………………….…………. 53 VI.1. P2X4 ioncsatorna…………………………………………………… 53 VI.2. TRPV6 ioncsatorna…………………………………………………. 56 VII. Következtetések……………………………………………………………. 58 VIII. Összefoglalás………………………………………………………………. 59 VIII. 1. Magyar nyelvű összefoglaló……………………………………... 59 VIII. 2. Angol nyelvű összefoglaló……………………………………….. 60. 3.

(6) DOI:10.14753/SE.2015.1718. IX. Irodalomjegyzék………………………………………….……………….… 61 X. Saját publikációk jegyzéke…………………………………………………... 73 X.1. Az értekezés alapját képező publikációk……………………………. 73 X.2. Egyéb publikációk……………………………………………………73 XI. Köszönetnyilvánítás………………………………………………………… 74. 4.

(7) DOI:10.14753/SE.2015.1718. I. Rövidítések jegyzéke ADP:. adenozin-difoszfát. AM:. acetoxi-metilészter. AMP:. adenozin-monofoszfát. AP:. alkalikus foszfatáz. ATP:. adenozin-trifoszfát. AUC:. görbe alatti terület (area under the curve). 5-BDBD:. 5-(3-Bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofuro [3,2-e]-1,4. diazepin-2one BSA:. borjú szérumalbumin. calbindin-D28K:. az emlős vesében expresszálódó kalcium-kötő fehérje altípus. cAMP:. ciklikus adenozin monofoszfát. cGMP:. ciklikus guanozin monofoszfát. CaV:. feszültségfüggő kalcium csatorna. [Ca2+]:. kalciumkoncentráció. [Ca2+]i:. intracelluláris Ca2+- koncentráció. CF:. cisztás fibrózis. CNT:. összekötő csatorna. CRAC:. kalcium felszabadulás által aktivált kalcium csatorna. DAG:. diacilglicerin. DCT:. disztális kanyarulatos csatorna. DMEM:. Dulbecco által módosított Eagle médium. DMSO:. dimetil-szulfoxid. EC50:. félmaximális aktivitáshoz szükséges koncentráció. ECL:. erősített kemilumineszcencia (enhanced chemiluminescence). Ecto-5’-NT:. ekto-5’-nukleotidáz. EDTA:. etilén-diamin-tetraecetsav. EGTA:. etilénglikol-diaminoetiléter-tetraecetsav. E-NPP:. ektonukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz. E-NTPD:. ektonukleozid trifoszfát difoszfohidroláz. ER:. endoplazmás retikulum. 5.

(8) DOI:10.14753/SE.2015.1718. FBS:. fötális borjúszérum. GPCR:. G-protein kapcsolt receptor. GTP:. guanozin-trifoszfát. GDP:. guanozin-difoszfát. HRP:. tormaperoxidáz (horseradish-peroxidase). I:. áramerősség. IC50:. félhatásos gátló koncentráció. IP3:. inozitol 1,4,5-triszfoszfát. IVM:. ivermektin. NCKX:. Na+-Ca2+-K+-cserélő fehérje. NCX:. Na+-Ca2+-cserélő fehérje. nH:. Hill-koefficiens. Orai1:. kalcium felszabadulás által aktivált kalcium csatorna fehérje 1. pA:. pikoamper. PFA:. paraformaldehid. PBS:. foszfátpuffer. PBST:. foszfátpuffer Tween 20-al. PIP:. foszfatidilinozitol-4 foszfát. PIP2:. foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát. PLC:. foszfolipáz C. PMCA:. plazmamembrán kalcium ATP-áz. PVDF:. polivinilidén-fluorid. P2X4:. ionotróp purinerg receptor X4-es típus. RyR:. rianodin receptor. ROI:. vizsgált terület (region of interest). RTK:. tirozin kináz receptor. SD:. szórás (standard deviation). SDS-PAGE:. nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis. SEM:. az átlag standard hibája (standard error of the mean). SERCA:. szarko(endo)plazmatikus retikulum Ca2+ ATP-áz. SOC:. raktár által vezérelt kalcium csatorna. STIM1:. stromal interaction molecule 1. 6.

(9) DOI:10.14753/SE.2015.1718. TM:. transzmembrán. TNP-ATP:. 2'-(vagy-3')-O-trinitrofenil ATP. TRPC:. tranziens receptor potenciál kanonikus alcsalád. TRPV5:. tranziens receptor potenciál vanilloid 5-ös típus. TRPV6:. tranziens receptor potenciál vanilloid 6-os típus. UDP:. uridin-difoszfát. UTP:. uridin-trifoszfát. UTR:. nem kódoló szakasz (untranslated region). 7.

(10) DOI:10.14753/SE.2015.1718. II. Bevezetés. II. 1. Az ioncsatornák Az ioncsatornák a sejtmembránt átérő ún. transzmembrán fehérjék, amelyek az ionok számára átjárható hidrofil bélésű pórusokat képeznek. Az ioncsatornák több alegységből felépülő ún. multimer fehérjék. A csatornák pórust alkotó alegységei hozzák létre az ionszelektív pórust, a hozzájuk kapcsolódó járulékos alegységek pedig a csatornák működését módosítják. A pórusokon keresztül az ionok passzív transzporttal jutnak át a sejtmembránon. Mivel a transzport sebessége meglehetősen nagy, így másodpercenként akár 108 ion is átjuthat a csatornán (1). A sejtmembrán egy négyzet mikrométernyi területén 1-1000 ioncsatorna található, a sejt, valamint a csatorna típusától függően (2). Az ioncsatornáknak funkcionális szempontból vezető és nem-vezető szerkezeti állapotát különböztethetjük meg. Vezető állapotban a nyitott csatornán ionok jutnak át a membránon. A nem-vezető állapotot a csatorna zárt, ill. inaktivált szerkezeti állapota jelenti. Az ioncsatornák egyes szerkezeti állapotai közötti átmenetet kapuzásnak nevezzük. A csatornáknak alapvető tulajdonsága a szelektív permeabilitás, ez esetben egy meghatározott csatorna csak egy, vagy néhány ion számára átjárható. Az ioncsatornák működése elengedhetetlen a sejtek életének fenntartásában. Sejttípustól függetlenül alapvető szerepet töltenek be például a nyugalmi membránpotenciál fenntartásában, az ingerlékeny sejtekben az akciós potenciál kialakításában, valamint a hámsejtek szekréciós és reabszorpciós folyamataiban. Számos betegség oka egy meghatározott ioncsatorna csökkent vagy fokozott működése, aminek következtében e betegségek elnevezésére egy új orvosi szakszó is létrejött: „channelopathies” (ioncsatorna-betegségek). A kóros működés oka lehet például a csatornát kódoló gén mutációja,. vagy. a. csatornafehérjék. elleni. autoantitestek. megjelenése. (1).. A plazmamembránban található, kation permeábilis ioncsatornákat és azok legfontosabb élettani szerepét az 1. táblázat foglalja össze (2).. 8.

(11) DOI:10.14753/SE.2015.1718. 1. táblázat. A plazmamembránban található kation csatornák és főbb élettani funkcióik.. Plazmamembrán kation permeábilis. Főbb élettani funkciók. ioncsatornák K+ csatornák. Elektromos jelátvitel Akciós potenciál repolarizációja. Hiperpolarizáció-által. aktivált. ciklikus cAMP- és cGMP- aktivált. nukleotid-függő kation csatornák. „funny áram” a szívben. Ciklikus nukleotid-függő kation csatornák. Érző. transzdukciós. mechanizmusok. a. látásban és a szaglásban Tranziens receptor potenciál (TRP) kation Polimodális csatornák. folyamatok. szenzoros. transzdukciós. (fájdalom,. viszketés,. hőmérsékletérzékelés, valamint a kémiai, mechanikai és ozmotikus stressz) Feszültség-függő Na+ csatornák. Akciós potenciál gyors depolarizációjának kialakítása ideg és izomsejtekben. Feszültség-függő Ca2+ csatornák. Transzmitter-. és. hormonszekréció. stimulálása, valamint az akciós potenciál depolarizációs fázisának meghosszabbítása szívizomsejtekben Ligand-függő kation csatornák. Excitatórikus posztszinaptikus potenciál (EPSP) kialakítása. Glutamát-által aktivált kation csatornák. Excitatórikus posztszinaptikus potenciál (EPSP) és hosszú távú potenciálódás kialakítása. Purinerg ligand-függő kation csatornák. Excitatórikus szinaptikus transzmisszióban való részvétel, valamint a véralvadás és a hámsejtek szekréciójának szabályozása. Epiteliális Na+ csatornák. Hámsejteken keresztüli Na+ transzport. Raktár-által vezérelt Ca2+ csatornák (Orai). Az intracelluláris Ca2+ raktárak ürülését követő extracelluláris Ca2+ beáramlás. 9.

(12) DOI:10.14753/SE.2015.1718. II. 2. Az ATP mint extracelluláris szignálmolekula Az ATP minden metabolikusan aktív sejtben jelen van. Legnagyobb mennyiségben a mitokondriális oxidatív foszforiláció során szintetizálódik, ezt követően pedig a citoplazmában található meg. Az ATP fiziológiás és patológiás körülmények között is kikerülhet a sejtekből az extracelluláris térbe (3). Az első leírás arról, hogy az extracelluláris adeninszármazékok biológiai hatással bírnak, még a huszadik század első felében jelent meg (4). Harminc évvel később azt feltételezték, hogy az ATP transzmitterként működik a szenzoros neuronokban (5). Ezt követően azonban még több mint tíz évnek kellett eltelnie ahhoz, hogy Geoffrey Burnstock egyértelműen igazolja, hogy az ATP részt veszt a sejtek közötti szignalizációban (6). Később a motoros idegekben (6, 7), majd egyes központi idegrendszeri neuronokban is leírták az ATP-t mint extracelluláris szignálmolekulát (8). Az intracelluláris ATP koncentráció ([ATP]i ~ 3-10 mM) lényegesen meghaladja az extracelluláris ATP koncentrációt. Ennek legfőbb oka az, hogy amint az ATP elhagyja a sejtet, az ektonukleotidázok gyorsan lebontják. Az enzimatikus hidrolízis során az ATP foszfátcsoportjai lehasadnak és előbb ADP, majd AMP és adenozin keletkezik belőle. Az extracelluláris ATP metabolizmusa különböző ektonukleotidázok révén szabályozódik, melyek az ektonukleozid trifoszfát difoszfohidroláz (E-NTPD-áz) család és az ektonukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz (E-NPP) család tagjai. Először a nagyenergiájú foszfát csoportot vágja le az ektonukleotidáz, majd az ekto-5’-nukleotidáz (ecto-5’-NT) és az alkalikus foszfatáz (AP) katalizálják a nukleotidok adenozinná alakulását (1. ábra). Az extracelluláris ATP és származékai a purinerg receptorok stimulálása révén számos sejtfunkció szabályozásában vesznek részt (9).. 10.

(13) DOI:10.14753/SE.2015.1718. 1. ábra. A purinoceptorok extracelluláris ATP-kötése és a reakciótermékek, melyek ektonukleotidázok által enzimatikus hidrolízis során keletkeznek. (ATP: adenozintrifoszfát, ADP: adenozin-difoszfát, AMP: adenozin-monofoszfát, Ecto-5’-NT: ekto-5’nukleotidáz, AP: alkalikus foszfatáz, E-NPP: ektonukleotid pirofoszfatáz/foszfodiészteráz, ENTPD: ektonukleozid trifoszfát difoszfohidroláz (10). Részleteket ld. a szövegben.. II. 3. Az intracelluláris kalcium-homeosztázis A kalcium-homeosztázis fenntartása nagyon fontos, hiszen a kalcium számos élettani folyamatban elengedhetetlen szerepet tölt be. Ezek közé tartozik például az immunválasz, az izomkontrakció, vagy a hormonszekréció szabályozása. Felnőtt emberben a kalcium összmennyisége hozzávetőlegesen 1 kg. A teljes kalcium kb. 99%a a csontokban található, a test kalciumtartalmának kevesebb mint egy százaléka pedig az extra- és az intracelluláris térben van jelen (11). A kalcium az egyik legfőbb másodlagos hírvivő. A kalciumkoncentráció [Ca2+] mintegy tízezerszer magasabb az endoplazmás retikulumban vagy az extracelluláris térben, mint a citoszólban. A legtöbb 11.

(14) DOI:10.14753/SE.2015.1718. sejtben a citoszólikus [Ca2+] 50-100 nM között van, míg az ER-ban és az extracelluláris folyadékban hozzávetőleg 1,2 mM (12) (2. ábra). Az ER-hoz hasonlóan a mitokondriumok is millimólos koncentrációban raktároznak Ca2+-ot (13). Az endoszómák, a Golgi vezikulák (akroszómák), a lizoszómák, a szekretoros granulumok és a melanoszómák membrán-kapcsolt kompartmentek, melyekből szintén történhet kalciumkiáramlás (14). A citoplazmatikus [Ca2+] emelkedhet a plazmamembránon át történő kalciumbelépés révén, valamint az intracelluláris raktárakból történő kalciumfelszabadulás által, amelynek forrása többnyire az endoplazmás retikulum.. 2. ábra. A Ca2+-gradiens fenntartása. A panel: alacsony citoplazmatikus Ca2+-szint nyugalmi körülmények között. B panel: az alapvető kalciumszabályozási útvonalak. (NCKX: Na+-Ca2+-K+-cserélő fehérje, NCX: Na+-Ca2+-cserélő fehérje, PMCA: plazmamembrán kalcium ATP-áz, SERCA: szarko(endo)plazmatikus retikulum Ca2+-ATP-áz, IP3: inozitol (1,4,5) triszfoszfát, IP3R: inozitol triszfoszfát receptor, RyR: rianodinreceptor, RTK: tirozin kináz receptor, DAG: 1,2-diacil-glicerol, PLC: foszfolipáz C, Ptdlns: foszfatidilinozitol, PIP: foszfatidilinozitol-4 foszfát, PIP2: foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát, GPCR: G-fehérje kapcsolt receptor, GTP: guanozin-trifoszfát, GDP: guanozin-difoszfát, CaV: feszültség-függő kalcium csatorna, TRP: tranziens receptor potenciál, CRAC: kalciumfelszabadulás által aktivált kalcium csatorna (15). Részleteket ld. a szövegben.. A plazmamembránon keresztüli kalciumbelépés történhet feszültségfüggő, vagy attól független ioncsatornákon keresztül. Ez utóbbiak közé tartoznak az ATP-függő P2X ionotróp receptor csatornák (16), valamint a tranziens receptor potenciál csatornák (17). Ingerlékeny sejtekben a kalciumbeáramlás főként a feszültségfüggő Ca2+-csatornákon 12.

(15) DOI:10.14753/SE.2015.1718. keresztül történik (12). Az extracelluláris térből történő kalciumbeáramlás mellett az intracelluláris raktárakból történő kalcium felszabadulás is növelheti a citoplazma [Ca2+]-ját, amely többnyire heterotrimer G-fehérjékhez kapcsolt plazmamembrán receptorok, valamint a tirozin kináz receptorok stimulációján keresztül valósulhat meg. E szignalizációban fontos szerepet kapnak a foszfolipáz C (PLC) enzim különböző izoformái. A foszfolipáz C enzim a sejtmembrán inozitol-biszfoszfát molekulájának hasításával inozitol 1,4,5-triszfoszfátot (IP3) és diacilglicerint (DAG) hoz létre. A DAG a protein kináz C (PKC) aktivátora, míg az IP3 az ER membránján található IP3 receptor csatornákhoz kötődve kalcium kiáramlást okoz az ER-ból a citoplazmába (18). Az ER membránján helyezkedik el az ún. „stromal interaction molecule 1” (STIM1), amely az ER kalciumszintjének csökkenését követően áthelyeződik a plazmamembrán irányába, ahol interakcióba lép és aktiválja az Orai 1 csatornát, mely kalciumbelépést indukál az extracelluláris térből (17). A kalcium indukált kalcium felszabadulás (CICR) is hozzájárulhat. az. ER-ből. történő. kalcium-kiáramlás. fokozódásához. (19).. A. citoplazmatikus kalcium eltávolítása több transzportrendszer működésének köszönhető. A plazmamembrán kalcium ATP-áz (PMCA) az elektrokémiai grádienssel szemben az extracelluláris térbe juttatja ki a Ca2+-okat. Ez az ionpumpa elektroneutrálisan cserél 1 Ca2+-t két protonra, ATP hidrolíziséből származó energia felhasználásával. A transzport kis kapacitással és nagy affinitással működik. A kalcium-kalmodulin komplex és/vagy az intracelluláris kalciumkoncentráció emelkedése a pumpa aktiválódásához vezet (15, 20). A Na+/Ca2+ (NCX) egy Ca2+-t cserél 3 Na+-ra, vagy a Na+/Ca2+-K+ (NCKX) egy Ca2+-t és egy K+-ot cserél négy Na+-ra (21, 22). Szintén az elektrokémiai gradienssel szemben a szarko-endoplazmatikus retikulum Ca2+-ATP-áz (SERCA) az intracelluláris raktárakba pumpálja vissza a kalciumot a citoszólból (23).. II. 4. A purinoceptorok A sejt felszínén található nukleotid receptorokat purinoceptoroknak nevezték el (24). A ʼPʼ jelölés arra utal, hogy e receptorok purin és pirimidin nukleotid vegyületek által aktiválódnak (25). A purinoceptoroknak két fő csoportját különböztetjük meg; a P1 és a P2 receptorokat (3. ábra). A hét transzmembrán domént tartalmazó P1 receptor család endogén ligandja az adenozin. A P1 receptorok négy altípusba sorolhatóak (A1, A2A, 13.

(16) DOI:10.14753/SE.2015.1718. A2B és A3), Gs vagy Gi heterotrimer G fehérjéhez kapcsolódnak és kompetitív gátlószereik a metilxantinok. A P2 receptorok alapvetően ATP, ADP, UTP és UDP által aktiválhatóak és két csoportra oszthatóak. A P2X ionotróp receptorok ATP-függő ioncsatornaként funkcionálnak és két transzmembrán domént tartalmaznak. Ezzel szemben a P2Y receptorok hét transzmembrán doménnel rendelkeznek, és heterotrimer G-fehérjék közvetítik az őket stimuláló agonisták hatásait (26). Az ionotróp P2X receptor csatornákat hét, a metabotróp P2Y receptorokat pedig nyolc altípusra oszthatjuk (27). A purinerg receptorok már az evolúció korai szakaszában megjelentek, és számos gerinctelen fajban is megtalálhatóak (28, 29). Működésüket tekintve a purinerg receptorok az ATP preszinaptikus és posztszinaptikus hatásaiban egyaránt részt vesznek (30-32), beleértve az ízérzést (33), a hallást (34) valamint a kemorecepciót (35).. 3. ábra. Az extracelluláris ATP és az adenozin plazmamembrán receptorai. A panel: Adenozin receptorok szerkezete. B panel: P2X ionotróp receptorok szerkezete. C panel: P2Y metabotróp receptorok szerkezete (10). Részleteket ld. a szövegben.. 14.

(17) DOI:10.14753/SE.2015.1718. II. 4. 1. P2Y metabotróp receptorok A P2Y receptorok G-proteinhez kapcsolt metabotróp receptorok. A P2Y receptorok aktiválása a heterotrimer G-fehérjéken keresztül intracelluláris másodlagos hírvivő molekulák képződéséhez vezet (36). Ez idáig nyolc emlős P2Y receptor altípust klónoztak (P2Y1,2,4,6,11,12,13,14). A P2Y1,2,4,6 altípusok Gq/G11 receptorhoz kapcsoltak, mely a foszfolipáz C aktivációján keresztül IP3 képződéséhez vezet. Ezzel szemben a P2Y12,13,14 receptor altípusok a Gi/Go feherjék által az adenilát-cikláz gátlásához vezetnek, ami a cAMP képződését csökkenti. A P2Y11 a Gs/Go fehérjék közreműködésével fokozza a cAMP szintézisét (37, 38). Ezek a receptorok lassúbb választ közvetítenek, mint a P2X receptorok, mivel másodlagos hírvivő rendszer is részt vesz a jelátviteli folyamatban. A metabotróp P2Y receptorok megtalálhatóak többek között a vérerekben (39), a csontokban (40), a gasztrointesztinális traktus sejtjeiben (41) és az epidermiszben (42). A P2Y metabotróp receptorok szinte minden emlős hámsejt apikális és/vagy bazolaterális membránjában jelen vannak. Az emberi hámsejtekben főként P2Y1, P2Y2, P2Y4 és P2Y6 altípusok expresszálódnak (37, 38). Fontos megemlíteni, hogy a különböző P2Y receptor altípusok extracelluláris nukleotidokkal való stimulálása Cl- szekréciót indukálhat olyan hámsejtekben, ahol a Ca2+-függő Cl- és K+ csatornák egyszerre vannak jelen (43). Következésképpen a P2Y receptorok stimulálása terápiás jelentőséggel bírhat olyan kórképekben, mint például a cisztás fibrózis (CF), amelyben a cAMP-függő Cl- szekréció károsodik (44).. II. 4. 2. P2X ionotróp receptorok A P2X receptoroknak hét altípusát különböztetjük meg (P2X1-P2X7) (16). Az ATP-által vezérelt P2X ionotróp receptorok két transzmembrán doménből állnak, egy N- és Cterminális régiót tartalmaznak a citoplazmában és nagy extracelluláris hurokkal rendelkeznek (45). Az extracelluláris hurok ciszteinben gazdag diszulfidkötéseket (16) és ATP kötőhelyeket tartalmaz (46, 47). Az ATP kötődése az extracelluláris domén megfelelő helyére konformációváltozást indukál, amely egy nem-szelektív kationcsatorna nyitásához vezet, melyen keresztül Na+, K+ és Ca2+ ionok szabadon áramolhatnak (48, 49). Minden P2X receptor permeábilis a Ca2+-okra nézve, azonban a. 15.

(18) DOI:10.14753/SE.2015.1718. Na+ -hoz viszonyított Ca2+ permeabilitás (PCa/PNa) eltérő az egyes altípusok között (50). A Na+ és Ca2+ beáramlás depolarizálja a membránt, illetve a szabad citoszólikus Ca2+ koncentráció ([Ca2+]i) is megemelkedik. Ez befolyásolja az akciós potenciál terjedését és hatással van számos Ca2+- függő folyamatra, beleértve a szekréciót (51, 52), az izom kontrakciót (53, 54) és a sejtek túlélését (55, 56). A P2X ionotróp receptorok alegységei homo- vagy heterotrimer formába rendeződhetnek. A heteromerizáció képes megváltoztatni az egyes P2X receptor altípusok funkcionális és farmakológiai tulajdonságait (27). A P2X ioncsatornák altípusai közül a P2X1 és a P2X3 homomer csatornák gyors deszenzitizációt mutatnak, ezzel szemben a P2X2 és P2X4 altípusok lassan deszenzitizálódnak, míg a P2X7 altípus nem mutat deszenzitizációt (16). A P2X receptorok szükségesek az immunrendszer megfelelő működéséhez is (57). A kardiovaszkuláris rendszerben, a légző-, az urogenitális, valamint a gyomor-bél rendszerben egyaránt megtalálhatóak P2X receptor altípusok, melyek fontos szerepet játszanak az élettani működések fenntartásában (58). Farmakológiai vizsgálatok és génkiütött állatokon végzett kísérletek során nyilvánvalóvá vált, hogy a P2X receptorok számos kórtani folyamatban is részt vesznek. Ezek közé tartoznak a krónikus és gyulladásos fájdalomérzékelés (59-64), az arthritis (65), a férfi meddőség (66), a magas vérnyomás (67, 68), a csontbetegségek és a rákos megbetegedések (56, 69).. II. 4. 2. 1. A P2X4 purinerg receptor A P2X4 receptor csatornák nagyfokú kalciumpermeabilitással rendelkeznek, mely a sejtmembrán depolarizációja mellett emeli az [Ca2+]i-t is, mely aktiválja a kalciumszenzitív intracelluláris folyamatokat (16, 70, 71). A P2X4 receptor csatornák megtalálhatóak a lizoszómákban is és az extracelluláris szignál hatására kihelyeződnek a sejt felszínére (72). A P2X4 fehérje altípust kódoló gént eredetileg patkányagyból klónozták (73). A P2X4 receptorok fontos szerepet töltenek be a neuropátiás fájdalomérzékelésben (63, 74), a gyulladásos folyamatokban (75), az endotélsejtek NOtermelésében (67), a légúti hámsejtek működésének szabályozásban (76), a légutak Clszekréciójának indukálásában (77, 78), valamint az epekiválasztás mechanizmusában (79). Ezen felül a receptorok fontos szerepet játszanak a neuronális, a zsigeri és a gyulladásos fájdalom folyamataiban (80). Nagy előrelépést jelentett, hogy nemrégiben a. 16.

(19) DOI:10.14753/SE.2015.1718. zebrahal P2X4 receptort sikeresen kristályosították mind zárt (81), mind nyitott állapotban (48). A cink alacsony mikromoláris koncentrációban (82, 83), valamint a makrociklikus lakton antibiotikum ivermektin potencírozzák az ATP hatását a P2X4 receptorokon (84). Mindazonáltal a P2X4 receptorok vizsgálatát megnehezíti a specifikus inhibitorok hiánya. Valójában a P2X4 receptorok inszenzitívek a nemszelektív P2X receptor gátlószerek iránt mint amilyen például a suramin és a PPADS (85). Irodalmi adatok azt mutatják, hogy a P2X4 receptorok gátlása esetén mind a suramin, mind a PPADS IC50 értéke >500 µM (86). A TNP-ATP nem specifikus módon gátolja a P2X4 receptorokat (87). Ráadásul a TNP-ATP a P2X4 csatornák gyenge gátlószerének bizonyult (IC50=15 µM; 10 µM ATP jelenlétében), szemben a P2X1 (IC50 = 0,006 µM) és a P2X3 (IC50 = 0,001 µM) receptorokon kifejtett potens gátló hatással (88). A benzodiazepin-származék, 5-(3-Bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofuro [3,2e]-1,4-diazepin-2-one (5-BDBD) P2X4 receptorokat gátló hatását vizsgálták korábban, és egy 2005-ben közzétett szabadalomban az IC50 érték közel 0,5 µM-nak adódott (89) (4. ábra). Mindazonáltal ezek az eredmények szabadalmi védelem alatt állnak, így nem hozzáférhetőek.. Valószínűleg. ennek. köszönhetően. a. kutatók. széles. koncentrációtartományban alkalmazzák az 5-BDBD-t a P2X4 receptorok gátlására. Néhány közleményben alacsony mikromoláris (5-10 µM) koncentrációban használták (90, 91), míg mások szignifikánsan magasabb dózisban (30-100 µM) alkalmazták (92, 93) az 5-BDBD-t. Jelen munkánkban megvizsgáltuk az 5-BDBD hatását a heterológ módon expresszált humán P2X4 receptorokon HEK-293 sejtekben.. 4. ábra. Az 5-BDBD szerkezeti képlete. 17.

(20) DOI:10.14753/SE.2015.1718. II. 5. TRP csatornák Több mint negyven évvel ezelőtt Cosens és Manning megfigyelték, hogy a mutáns ecetmuslica (Drosophila melanogaster) retinájában hosszú ideig tartó fénymegvilágítás hatására Ca2+ permeábilis ioncsatornák aktiválódnak, mely fenntartott receptorpotenciált eredményez. Innen ered a két évtizeddel később leírt tranziens receptor potenciál (TRP) csatornák elnevezése (94). A TRP fehérjék kationpermeábilis csatornák, melyek az élesztőtől az emlősökig számos sejttípusban megtalálhatóak (95, 96). A TRP szupercsaládnak hét fő alcsaládját különböztetjük meg: TRPC (canonical), TRPV (vanilloid), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), TRPML (mucolipin), TRPA (ankyrin) és a TRPN (nem mechanoreceptor) (95, 97, 98). A TRPV családon belül a gerincesekben hat altípust azonosítottak. A TRPV1 a fájdalomérzékelésben, valamint a kémiai és hőmérsékleti stimulusok közvetítésében játszik szerepet (99, 100). A TRPV2 és TRPV3 receptorok a hőmérséklet emelés hatására nyílnak, melegben és ártalmas hőmérsékleti tartományban aktiválódnak (101, 102). A TRPV4 receptorok az ozmotikus viszonyok változásának érzékelésében, a nocicepcióban és a meleg érzékelésben vesznek részt (103, 104). A vesetubulusok hámsejtjeiben és a bélhámsejtekben a TRPV5 és a TRPV6 csatornák kulcsfontosságú szerepet töltenek be a Ca2+ reabszorpcióban (105, 106). Nem meglepő módon a TRP csatornák közül a TRPV5 és a TRPV6 rendelkezik a legnagyobb Ca2+-szelektivitással, (PCa/PNa értékük meghaladja a 100-at). Következésképpen, egyedülállóak a TRP szupercsaládban az intracelluláris kalciumszabályozásban betöltött szerepük révén (107).. II. 5. 1. TRPV6 csatorna A TRPV6 (régebbi nevén „calcium transporter 1” - CaT1) csatornát több mint egy évtizeddel ezelőtt azonosították és klónozták (108, 109). A humán TRPV6 gén a 7q34 kromoszómán található (109). A humán TRPV6 promóter régiója számos D-vitamin receptor kötőhelyet tartalmaz, melyek a 1,25-dihydroxivitamin D3 által részt vesznek a TRPV6 expressziójának a szabályozásában (110, 111). A TRPV6 receptor 725 aminosavból épül fel, hat transzmembrán doménből áll, és intracellulárisan N- és C terminális régióval rendelkezik (5. ábra). A pórus régió feltehetőleg az ötös és a hatos. 18.

(21) DOI:10.14753/SE.2015.1718. transzmembrán doménok között található. A TRPV6 aktivitását a PKC és a kalmodulin szabályozzák. A fehérje N-terminális része három ankirin kötőhelyet tartalmaz. A TRPV6 receptor aminosav-szekvenciája legjobban a TRPV5 fehérjével mutat egyezőséget (112, 113).. 5. ábra. A TRPV6 csatornák szerkezete (11). A panel: A TRPV6 receptor hat transzmembrán doménből épül fel. Intracellulárisan N- és C terminális régiót tartalmaz. Három ankirin kötőhely foglal helyet a fehérje N-terminális régióján. B panel: A tetramer pórus régió vélhetően az ötös és a hatos transzmembrán doménok között figyelhető meg.. A TRPV6 fehérjéről azt feltételezték, hogy része a kalcium által aktivált plazmamembrán kalciumcsatornának (114, 115). Ezt a feltételezést azonban nem sikerült egyértelműen igazolni, hiszen az endogén ICRAC tulajdonságai eltérnek a heterológ módon expresszált TRPV6 tulajdonságaitól (116). Természetesen a különbség az expressziós rendszerben lévő kifejeződés szintjétől függ (117). A TRPV5, valamint a TRPV6 csatornák homo- vagy heterotetramer formába rendeződhetnek (118). A duodenumban és a placentában főként TRPV6 csatornákon keresztül zajlik a Ca2+ reabszorpció. A hasnyálmirigy, a prosztata és a nyálmirigyek hámszöveteiben a TRPV6 csatorna funkciója máig tisztázatlan (108, 117). A vesetubulusok hámsejtjeiben történő Ca2+ reabszorpció a TRPV5 és TRPV6 csatornákon keresztül történik (6. ábra). A disztális kanyarulatos csatornában (DCT) és az összekötő csatornában (CNT) a transzcelluláris kalciumreabszorpció három lépésben zajlik. Elsőként Ca2+ áramlik a hámsejtekbe az apikális membránban lévő TRPV5 és TRPV6. 19.

(22) DOI:10.14753/SE.2015.1718. csatornákon keresztül. Ezt követően a Ca2+ kalcium-kötő fehérjéhez kötődik (CalbindinD28K) és átdiffundál a citoplazmán anélkül, hogy az [Ca2+]i szignifikánsan emelkedne. Végül a Ca2+ a bazolaterális membránon át távozik a PMCA vagy a Na+/Ca2+cserélő (NCX) segítségével (11).. 6. ábra. A Ca2+ abszorpció mechanizmusa a vese epitheliumában. TRPV5: transiens receptor potenciál vanilloid 5-ös típus, TRPV6: transiens receptor potenciál vanilloid 6-os típus, PMCA1b: plazmamembrán kalcium ATP-áz 1b típus, NCX1: Na+-Ca2+-cserélő fehérje 1-es típus, DCT: disztális kanyarulatos csatorna, CNT: összekötő csatorna, calbindin-D28K: az emlős vesében expresszálódó kalcium-kötő fehérje altípus (11).. A TRPV6 fehérje működésének vizsgálatát nehezíti az a körülmény, hogy jelenleg a csatornának nincs specifikus és hatékony gátlószere. A Zn2+ és a Cd2+ gátolja a TRPV6ot magas mikromoláris (200-2000 µM) koncentrációban (117). Jelen munkánkban megvizsgáltuk az IP3 receptor és a raktár vezérelt Ca2+ csatornák gátlószereként ismert 2-APB hatását a TRPV6 csatornákon (119).. 20.

(23) DOI:10.14753/SE.2015.1718. III. Célkitűzések 1. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a heterológ módon expresszált humán P2X4 purinerg receptor csatornák működését HEK-293 sejtekben. Tanulmányozni kívántuk továbbá a benzodiazepin származék, 5-BDBD gátló hatását a humán P2X4 receptorokon az intracelluláris kalciumkoncentráció változásának nyomon követésével és a teljes-sejt ionáramok detektálásával. 2. További célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a heterológ módon expresszált humán TRPV6 csatornák működését HEK-293 sejtekben. Arra is kerestük a választ, hogy a belső raktár vezérelt Ca2+ csatorna gátlószereként ismert 2-APB hogyan befolyásolja a hTRPV6 csatornák működését.. 21.

(24) DOI:10.14753/SE.2015.1718. IV. Módszerek IV. 1. Sejttenyésztés Kísérleteinkhez humán embrionális vese (HEK)-293 hámsejtvonalat használtunk. A HEK-293 sejteket már több mint harminc éve alkalmazzák rekombináns fehérjék tanulmányozására. Azért esett a választásunk e sejtvonalra, mert ezek a sejtek gyorsan osztódnak, könnyen fenntarthatóak, és ideálisak tranziens és stabil expressziós rendszer létrehozására, ugyanakkor magas hatásfokkal transzfektálhatóak. A HEK-293 sejtek kiválóan alkalmasak elektrofiziológiai módszerekkel történő funkcionális vizsgálatokra (120). A kísérleteinkhez használt HEK-293 sejteket műanyag szövettenyésztő edényben 5% borjúsavót (FBS), 100 U/ml penicillint és 100 µg/ml streptomycint tartalmazó DMEM/Ham’s F-12 (1:1 v/v) médiumban tenyésztettük. A sejteket 5% CO2 jelenlétében, 37ºC-os sejttenyésztő inkubátorban tartottuk fenn. A passzálás 90-95%-os konfluencia elérésénél történt. IV. 2. Konstrukt készítés IV. 2. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 készítése A humán P2X4R-t (ImaGenes GmbH, Berlin, Németország) humán cDNS-ből amplifikáltuk az alábbi primer párral: 5’-TAT AAG ATC TCG CGG CCA TGG CGG GC-3’, 5’-TAT AGA ATT CCC TGG TCC AGC TCA CTA GCA AGA CCC TGC-3’ Az amplifikált terméket a pmCherry-N1 (Clontech Laboratories Inc.) vektor BglII és EcoRI resrikciós helyeire szubklónoztuk. A humán P2X4 receptorok izoformája 3-as típusú. IV. 2. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 készítése A humán TRPV6-ot cDNS-ből amplifikáltuk PCR-al a következő primerekkel: 5’-UTR TCT GCA GTC GAC GGT ACC GCG GGC CCG GCC CTA CAC CCC ATG UTR3’, 3’-UTR AAA AAA CTC GAG CAT GCA TCT AGA TAA CTG ATCA UTR-5’ A primerek UTR (nem kódoló) szekvenciát is tartalmaztak. A pEYFP-C1-hTRPV6. 22.

(25) DOI:10.14753/SE.2015.1718. vektort Prof. Christoph Romanin-tól kaptuk (Johannes Kepler Egyetem, Biofizikai Intézet, Linz, Ausztria), ahonnan az amplifikált terméket SacII és XhoI segítségével tettük át a pTagRFP-C1 vektorba. IV. 3. Tranziens transzfekció IV. 3. 1. A pmCherry-N1-hP2X4 transzfekciója A transzfekció előtti napon, a sejteket 40 mm-es műanyag Petri-csészékben lévő, poliD-lizin bevonatú, kerek, üveg tárgylemezekre (25 mm átmérő) szélesztettük, tárgylemezenként 500.000 sejtszámmal. A sejtek transzfekcióját 16-24 óra elteltével 3 µg pmCherry-N1-hP2X4 DNS-el és 5 µl TurboFectTM transzfekciós reagenssel végeztük el 200 µl szérum-mentes médiumban. A méréseket a sejteken a transzfektálást követő 16-48 óra elteltével végeztük. A transzfekció hatásfoka 60-70% volt. IV. 3. 2. A pTagRFP-C1-hTRPV6 transzfekciója A HEK-293 sejteket a transzfektálást megelőző 24 órával poli-D-lizinnel előkezelt tárgylemezekre szélesztettük, melyeket 35 mm-es Petri-csészékben helyeztünk el. A transzfekciót 2 µg pTagRFP-C1-TRPV6 és 5 µl Lipofectamine 2000 nevű transzfekciós reagenssel végeztük el a gyártó cég által ajánlott protokoll alapján. A transzfekciós médiumot 4 óra múlva antibiotikum-mentes médiumra cseréltük le. A transzfekció után 24 óra múlva használtuk fel a sejteket. IV. 4. A pmCherry-N1-hP2X4-et és a pTagRFP-C1-hTRPV6 expresszáló HEK-293 sejtklónok létrehozása A pmCherry-N1-hP2X4-et, valamint a pTagRFP-C1-hTRPV6-ot expresszáló HEK-293 sejtklónok létrehozásához a sejteket 35 mm átmérőjű Petri csészében lévő, poli-Dlizinnel előkezelt, steril tárgylemezekre szélesztettük. A transzfektáláshoz 2 µg pmCherry-N1-hP2X4-et, illetve pTagRFP-C1-hTRPV6-ot és 5 µl Lipofectamine 2000-t használtunk lemezenként, a gyártó cég által leírt protokoll szerint. A transzfekciós tápoldatot 4 óra múlva antibiotikum-mentes médiumra cseréltük le. A következő napon a médiumot szelekciós antibiotikumot tartalmazó (G418) tápoldatra cseréltük, és ebben a szelekciós médiumban tartottuk őket. A nem transzfektálódott sejtek pusztulását követően, a túlélő sejteket tripszineztük, és újraszélesztettük 96-lyukú lemezre. A 23.

(26) DOI:10.14753/SE.2015.1718. hígítást úgy készítettük el, hogy 1 lyukba 1 darab sejt kerüljön. Az ezt követő napokon a pirosan fluoreszkáló sejtkolóniák, mint a hP2X4-et és a hTRPV6-ot expresszáló pozitív klónok, fluoreszcens mikroszkóppal kerültek kiválasztásra. IV. 5. Sejtfelszíni biotiniláció és western blot A P2X4-et és TRPV6-ot kifejező HEK-293 sejtklónokat poli-D-lizinnel előkezelt, 1.000.000 sejt/tárgylemez sűrűségben tettük ki 60 mm átmérőjű tenyésztőedényekbe. A sejteket, 24 órával a kitapadás után, jéghideg PBS-Ca-Mg (0,1 mM CaCl2 és 1 mM MgCl2) oldatban mostuk, ezt követte a plazmamembrán-fehérjék biotinilációja 1,5 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotin-al 10 mM trietanolaminban (pH 7,4), 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 és 150 mM NaCl jelenlétében 90 percen keresztül, horizontális rázatás mellett, 4ºC-os hőmérsékleten. A felesleges biotint 1mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2 és 100 mM glicin-t tartalmazó PBS-el távolítottuk el, 20 percen keresztül 4ºC-on, majd háromszor mostuk PBS-ben. Végül a sejteket lízis pufferben lizáltuk 30 percen át és a lizátumot centrifugálással tisztítottuk meg. A fehérje koncentrációját DC Protein Assay módszerrel határoztuk meg. A sejt lizátum azonos mennyiségű fehérjét tartalmazott (1,33 mg/ml), amelyhez streptavidin-agaróz gyöngyöket kevertünk egy éjszakán át, 4ºC-on. A gyöngyöket egymás után háromszor mostuk A oldattal [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl és 5 mM EDTA], kettőször B oldattal [50 mM Tris-HCl (pH 7,4) és 500 mM NaCl] és egyszer C oldattal (50 mM Tris-HCl, pH 7,4). A biotinilált felszíni fehérjéket 95ºC-on főztük 4x Laemmli pufferben. Az intracelluláris frakcióból kapott fehérjéket 95ºC-on 5 percen át főztük 4x Laemmli pufferben. A P2X4-et expresszáló mintáinkat 10%-os SDS-PAGE gélen futattuk, amelyre 40 µl fehérjét vittünk fel a citoszólikus fehérjéből (1 mg/ml) és a plazmamembrán-fehérjéből egyaránt. Towbin pufferben transzferáltuk a mintákat PVDF membránra, ehhez félszáraz transzfert használtunk. A membránok blokkolását szobahőmérsékleten végeztük el egy órán keresztül PBS-ben oldott 5%-os tejporoldattal, mely 0,5% BSA-t és 0,02% NaN3-t tartalmazott. Ezt követően a mintákat a megfelelő primer antitestet tartalmazó (1:1000 egér anti-mCherry (Clontech, 632543)) blokkoló oldatban inkubáltuk egy éjszakán át 4ºC-on, majd háromszor mostuk foszfátpuffer Tween 20 (PBST) oldatban. A szekunder antitest tormaperoxidázzal (HRP) konjugált kecske antiegér (1:4000, BioRad) antitest volt. Folyamatosan PBST-ben történő háromszori mosást 24.

(27) DOI:10.14753/SE.2015.1718. végül PBS-es mosás követte, a detektálásra kemilumineszcens (ECL) módszert használtunk. Kontrollként az anti-mCherry antitesttel jelölt membránt sztrippeltük és avidin-HRP (1:1000, BioRad)-al blottoltuk. A TRPV6-ot tartalmazó mintánkat 8%-os SDS-PAGE gélen futattuk, amelyre 20 µg proteint adagoltunk a teljes és a citoszólikus fehérjéből egyaránt. Ebben az esetben is félszáraz transzfert alkalmaztunk, azonban a mintákat Dunn puffer segítségével transzferáltuk át PVDF membránra. A membránokat egy éjszakán át blokkoltuk PBSben oldott 5%-os tejporoldattal, mely 0,5% BSA-t és 0,02% NaN3-t tartalmazott. Ezután a mintákat a megfelelő primer antitestet tartalmazó (1:2000 nyúl anti-tRFP (Evrogen AB233)) blokkoló oldatban inkubáltuk szobahőmérsékleten 1,5 órán keresztül, majd háromszor mostuk PBST oldatban. A másodlagos antitest tormaperoxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-nyúl (1:20,000, Santa Cruz SC1616) volt. Folyamatosan PBSTben történő háromszori mosást végül PBS-es mosás követte, a detektálásra kemilumineszcens (ECL) módszert használtunk. IV. 6. Immunofluoreszcencia A 35 mm-es tenyésztő edényben lévő, 400.000 darab P2X4-et kifejező HEK-293 sejt klónok kitapadását követő 24 órával a sejteket PBS-ben mostuk. Az inkubálást 0.1 mg/ml LC-sulfo-NHS(+)-biotin (Molbio)-val végeztük el szobahőmérsékleten 1 órán át, ezt PBS-el történő mosás követte háromszor egymás után. A fixálás 4% PFA-val történt 37ºC-on 15 percig. Majd, a háromszori PBS-es mosást követően, a sejteket sztreptavidin konjugált Alexa 488 (1:4000 hígítás, Invitrogen)-al jelöltük 1 órán át szobahőn. Végül négyszeri PBS-es mosás után, a mintákat CitiFluor AF2 (EMS)-vel jelöltük. A képeket Nikon C1 konfokális lézer szkenning mikroszkóppal tettük láthatóvá, ehhez Multiline Argon és HeNe lézereket használtunk 40x nagyítással. IV. 7. Intracelluláris [Ca2+] mérése IV. 7. 1. Az egyes sejtek szintjén történő kalciummérés A tranziensen transzfektált HEK-293 sejteket Fluo-3 AM (acetoxi-metilészter) (4 µl) festékkel. töltöttük. fel. standard. extracelluláris. oldatban,. 45. percen. át,. szobahőmérsékleten. A fluoreszcens festéket dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk,. 25.

(28) DOI:10.14753/SE.2015.1718. mely 20% Pluronic-F127-et (a festék bejutását megkönnyítő enyhe detergens) tartalmazott. Emellett a feltöltő oldatba 1 mM probenicidet is tettünk, a festék szivárgásának megelőzése érdekében. A feltöltés után a sejteket standard extracelluláris oldattal mostuk. Az oldat összetétele (mM-ban): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 D-glükóz és 10 HEPES, pH 7,4 (NaOH-dal). A nominálisan Ca2+-mentes oldatokat CaCl2 hozzáadása nélkül készítettük. A méréseket Axiovert 200 M Zeiss LSM 510 Meta konfokális lézer szkenning mikroszkóp segítségével végeztük (Carl Zeiss, Jena, Németország) 20x nagyításon (NA=0,80) DIC objektívvel. Az excitációhoz 488 nm hullámhosszúságú argon-ion lézert használtunk. A kibocsátott fény szűrését az emissziós oldalon BP 505-570 filter segítségével értük el. Az adatok regisztrálása 0,5 Hz-en történt. Az [Ca2+]i változásait a kísérlet kezdetén detektálható relatív fluoreszcencia érték %-ában mutattuk be. A sejteket standard extracelluláris oldatban tartva határoztuk meg az alapfluoreszcencia értéket (100%) a ROI-k (region of interests) által kapott átlagfluoreszcencia értékből. A háttérfluoreszcenciát, mely a tárgylemez sejtmentes területén mérhető, kivontuk az alap fluoreszcens intenzitásból. Az agonistákat és az antagonistákat közvetlenül adagoltuk az oldatba a kívánt koncentrációban. A kísérleteket szobahőmérsékleten (22-24ºC) végeztük. IV. 7. 2. Fluoreszcens intracelluláris [Ca2+] mérés A sejttenyészet intracelluláris kalcium koncentrációjában bekövetkező változást Fura-2acetoxi-metilészterrel (Fura-2 AM) mértük. A mérés elve, hogy a kalciumot kötött és nem kötött fluoreszcens festék abszorpciós spektruma eltérő 380 nm-en, illetve 340 nmen történt excitációt követően. Amennyiben a festéket tartalmazó mintát két váltakozó hullámhosszon gerjesztjük, az emittált fénysugarak intenzitásának hányadosából meghatározható a minta intracelluláris kalcium koncentrációja (121). A módszer előnye, hogy eltekinthetünk a megvilágító fény intenzitásától, és a sejt által felvett festék koncentrációjától. Az azonos tárgylemezen található transzfektált és nem-transzfektált sejteket szérummentes médiumban oldott 5 µg/ml Fura-2 AM (a törzsoldat 5 µg/µl) festékkel töltöttük fel 1 órán keresztül, 37°C-os sejtkultúra inkubátorban. A festéket DMSO-ban. 26.

(29) DOI:10.14753/SE.2015.1718. oldottuk fel, mely 20% Pluronic-F127-et és 1 mM probenicidet tartalmazott. Ezt követően a sejteket módosított, nominális kalcium-mentes Krebs-Ringer HEPES (KRH) (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM D-glükóz, és 10 mM HEPES, pH 7,4) oldatba helyeztük 20 percre. Ez idő alatt a sejtek felvették a festéket, amely az acetoxi-metilészter által membránpermeabilissá vált. A sejt észteráz enzime eltávolította a citoplazmába került festékmolekuláról az AM-csoportokat, ezáltal a festék a sejtekben halmozódik fel. A méréseket Nikon Eclipse TiU inverz mikroszkóppal végeztük. A sejteket Nikon 40x S Fluor objektívvel vizsgáltuk. A képeket hűtött Hamamatsu Orca-EG monokróm CCD kamera segítségével készítettük. A képalkotást és az analízist SimplePCI 6.2 CImaginggel végeztük. IV. 7. 3. FLIPR Tetra módszer Az endogénen jelen lévő P2Y receptorok vizsgálatára natív HEK-293 sejteket használtunk. A P2X4 receptorok vizsgálatához P2X4 fehérjéket kifejező HEK-293 sejt klónokat alkalmaztunk. A kísérlet kezdete előtt 36 órával a lemezeket 100 µg/ml poliD-lizinnel vontuk be, majd a sejteket tripszineztük és 100 µl térfogatban 40.000 sejt/lyuk sűrűségben 96-lyukú lemezre szélesztettük. Az oldatot 36 órával később 100 µl módosított Krebs oldatra cseréltük (117 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1 mM CaCl, 1 mM MgCl, 5 mM D-glükóz, 10 mM HEPES és Calcium-5 fluoreszcens festék), a sejteket ebben az oldatban 1 órán át inkubáltuk 37ºC-on. A fluoreszcens [Ca2+] méréseket nagy teljesítményű FLIPR Tetra fluoreszcens mikroplate olvasóval végeztük. A sejteket 470495 nm hullámhosszúságú LED modullal gerjesztettük, az emisszióhoz 515-575 nm-es filtereket használtunk. Az alapvonal felvétele után a sejteket 5 percen át előkezeltük a különböző vegyületekkel, majd ezt követte a tesztelni kívánt anyagok hatásának vizsgálata ATP jelenlétében és ATP hozzáadása nélkül. IV. 8. A Ca2+-belépés vizsgálata mangán „quench” módszer alkalmazásával A sejteket Fura-2 AM festékkel töltöttük fel. A Fura-2 festék gerjesztésére az ún. izobesztikus pontnak megfelelő 359 nm hullámhosszúságú fényt használtuk, így a festék Ca2+-független fluoreszcenciaváltozásait tudtuk detektálni. MnCl2 (250 µM) hozzáadása után a Mn2+ belépéstől függően csökken az emittált fény intenzitása. A 27.

(30) DOI:10.14753/SE.2015.1718. csökkenés mértékét a görbékhez húzott érintő meredekségéből határoztuk meg. A kísérletek során a MnCl2-ot az EGTA-mentes oldathoz adtuk. IV. 9. Elektrofiziológia A „voltage clamp” méréseket a standard teljes sejt (whole-cell) konfigurációban végeztük, melyekhez egy Axopatch 200B erősítőt használtunk (Axon Instruments). (122). A humán P2X4-et expresszáló sejteket Diaphot 300 invert patch clamp mikroszkóp (Nikon) alatt válogattuk ki, mely egy epifluoreszcens egységet is tartalmazott (Elektro-Optika, Érd, Magyarország). A mikropipettákat egy P-97 FlamingBrown típusú készülék segítségével (Sutter Instrument) boroszilikát üvegkapillárisokból (Harvard Apparatus) készítettük el. A pipettahegyek ellenállása 3-6 MΩ között volt, miután pipettaoldattal töltöttük fel azokat. A pipettaoldat összetétele (mM-ban): 135 KCl, 5 NaCl, 1 MgCl2, 1 EGTA, 10 HEPES és annyi CaCl2, hogy a szabad [Ca2+]i = 0,1 µM volt. A szabad [Ca2+]i-t MaxChelator szoftverrel (Stanford University, Palo Alto, USA) becsültük meg. A pH-t 7,2 értékre állítottuk be KOH-dal. A standard extracelluláris oldat összetétele (mM-ban): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 Dglükóz, 10 HEPES, pH 7,4 (NaOH-dal). Az oldatokat folyamatos perfúzióval áramoltattuk a sejtekre, egy gravitáció által működtetett rendszer segítségével. Az antagonisták oldatba juttatása 3-5 perccel az agonista adása előtt történt. A kísérletekben a membrán potenciált -60 mV-os értékre állítottuk be. A feszültség lépcsők létrehozását és az adatgyűjtést pClamp 6.03 szoftver (Axon Instrument) segítségével végeztük. A kapacitatív áramokat analóg módon kompenzáltuk. A bemeneti soros ellenállás érték abban az esetben került elfogadásra, ha ez az érték nem haladta meg a pipettahegy ellenállás 5-szörösét. Az analóg adatokat Bessel szűrő segítségével szűrtük és Digidata 1200 analóg digitális konverterrel digitalizáltuk. Az adatfeldolgozáshoz Clampfit 6.03 és Microsoft Excel szoftvereket használtunk. Minden kísérletet szobahőmérsékleten (20-22°C) végeztünk. IV. 10. Statisztika A görbe alatti terület kiszámítása trapéz szabály alapján történt az agonista adását követő 4 perc után, melyhez SigmaPlot 12.0 szoftvert használtunk. A P2X receptor funkció meghatározásához a nem expresszáló sejtek válaszát kivontuk a P2X4 receptort. 28.

(31) DOI:10.14753/SE.2015.1718. kifejező sejtek görbe alatti területének értékéből minden egyes tárgylemezen. Az antagonista koncentráció gátlás görbe meghatározásához fokozatosan emeltük a vegyület koncentrációját, miközben az agonista koncentrációját az EC50 (fél maximális aktiváláshoz szükséges koncentráció) érték közelébe állítottuk be. Az IC50 értéket (fél hatásos gátló koncentráció) a legkisebb négyzetek elve alapján számítottuk ki I=I0/[1+(IC50/[Ant])-nH], ahol I és I0 a maximális válaszokat mutatják az antagonista [Ant] jelenlétében és hiányában. Az eredményeket átlag ± SEM formájában adtuk meg. A megfigyelés számát az „n” jelöli. A statisztikai feldolgozás során a parametrikus adatokat páros Student’s t-próbával, míg a nem parametrikus adatokat egy változós varianciaanalízissel és Mann-Whitney U teszttel elemeztük. Az eltéréseket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha a p˂0,05. A nem lineáris görbe meghatározásához SigmaPlot 12.0 programot használtunk.. 29.