Kiroptikai spektroszkópia

Kiroptikai spektroszkópia

Bevezető

• A kiroptikai spektroszkópiák jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt.

– Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon),

– ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében)

– CD /cikuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz

függvényében)

• Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a polarizált fény közti kölcsönhatás mérésén alapszik.

Optikailag aktív, királis anyag

• Az olyan anyagokat, amelyek a poláros fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták összefüggésbe).

– Arago, kvarckristály (1811)

– Biot, borkősav vizes oldat (1838)

– Pasteur, tartarát só kristályokból oldat - aszimmetria – optikai aktivitás (1848- 53)

– Le Bel és van't Hoff (1874); aszimmetrikus, tetraéderes C-atom

Aimé Cotton (1869 - 1951) ORD-spektroszkópia,

CD-spektroszkópia kifejlesztője

Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir - származik az ilyen szerkezetek királis elnevezése).

Optikai aktivitás = forgatóképesség; királis molekulák nem racém halmaza optikailag aktív

Enantiomerek: tükörképi pár

• Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk;

„ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak).

• Szimmetrikus környezetben:

azonos fizikai és kémiai tulajdonságok

• Aszimmetrikus környezetben:

különböző tulajdonságok.

Királis molekulák egymáshoz való viszonya

Enantiomerek spektrumai

• Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum.

• A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül:

– Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik – Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl.

diasztereomer képzés, rezolválás alapja)

– „Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön

• (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak;

1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút

Kiralitás fajtái

C COOH

CH₃ NH₂ H

helikális kiralitás:

hexahelicén

O

OH OH OH

HO OH

O

OH OH OH

HO OH

CHO

HO H

H OH

HO H

HO H

CH₂OH

kiralitás- centrum

kiralitástengely

kiralitás-sík

kumulén

biaril

A fény polarizációja

Az elektromágneses

sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek

kölcsönösen merőlegesek egymásra. Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y,x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált.

x y

z

Nem polarizált fény

Síkban

polarizált fény

Síkban polarizált fény előállítása

Polarizálatlan fény

A vertikálisan polarizált komponens átjut.

A horizontálisan polarizált komponens abszorbeálódik (nem jut át a szűrőn).

A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely

hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik).

Optikai forgatás

• A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve.

• n_bal≠njobb

• Ebből következően a két cirkuláris komponens sebessége más és más, amint királis mintán haladnak át.

• n=c/v

• Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul ( szöggel).

Polarimetria: Az optikai forgatás adott hullámhosszon

/589nm (Na D-vonal)/

Optikai forgatás

• Általában specifikus forgatásként van megadva [], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon (, ált. 589 nm)

mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva).

• Megadása: []_D25 = +65° (c=1.0, EtOH)

• +, óramutató járásával megegyező irány

• – , óramutató járásával ellentétes

• Optikai tisztaság meghatározás:

– Mért specifikus forgatás*100 tiszta minta specifikus forgatása (Pl.: (+6,76°/+13,52°)*100=50%)

Optikai rotációs diszperzió (ORD)

• Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében)

hangolható fényforrás

(lámpa + opt. rács)

Detektor:

fotoelektron sokszorozó

ORD spektrum

• Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés).

A + és – sáv közötti

tengelymetszet hullámhossza jól egyezik az abszorpciós

_max –al..

CD spektrum

• A CD spektrumban A-t,

-t (egyezményesen _bal-

jobb) tüntetik fel a

hullámhossz függvényében.

(néha az ellipticitást (), a moláris ellipticitást [])

• A_balA_jobb A /c·l

• (A=A_bal-A_jobb)

 = _bal-_jobb

=190-800nm, e^- gerjesztés

A A_jobb

A_bal

Enantiomerek CD spektruma

 _jobb,(R)= _bal,(S),  _bal,(R)= _jobb,(S)

 _{bal, (R)}- _jobb,(R) = _(R) =  _{jobb, (S)}- _bal,(S) =  _(S)

 _{bal, (S)}- _jobb,(S)= _(S)=  _{jobb, (R)}- _bal,(R)= _(R)

TÜKÖRKÉPI VISZONY

CD mérés (spektropolariméter)

• Ahol az

optikailag aktív anyag elnyel: CD jel jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus.

• Ahol az anyag nem nyel el:

UV, ORD, CD

összefüggése

A CD spektroszkópia alkalmazásai

• Enantiomertisztaság meghatározás

• Abszolút konfiguráció meghatározás

• Indukált CD: akirális molekuláknak – királis molekulákhoz kötődve – CD jele indukálódik (komplexképződés

tanulmányozása).

• Fehérjék tanulmányozása: másodlagos

szerkezet, konformációs változások

Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás

• Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság).

• A racém részen felüli túlsúly.

100

 R  S ee

Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?]

• Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba.

• Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak.

• Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a

nemkívánt hatásokért felelős

Racémként hozták forgalomba

• A tájékoztató szerint jól használható köhögés,

pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén

nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a

hányingert is csillapítja.

• Célcsoport: állapotos nők.

• Feltűnően sok gyermek

született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg

Contergan-botrány (hatóanyag:thalidomide)

• (R)-izomer (S)-izomer

teratogén hatású hatékony szedatívum

Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása

• Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R):

bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor.

• Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító.

• Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus

artritis (izületi gyulladás) ellen –

Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei

• (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyülethasonló, ismert térszerkezetű vegyület.

• (2): Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály)

• (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és

ennek összevetése a mért spektrummal.

Példa (1)

O O

H H

(2R,3S)

(-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció

O O H O O H

H

CH₃

Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció

Oktáns szabály

(ketonokra) (2)

• Adott molekula- geometriához

meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül

észlelhető n→π*

elektronátmeneté hez tartozó CD jel előjele.

O

x

y

z O

A molekula 3D modelljét úgy kell elhelyezni a koordináta rendszerben, hogy a karbonil

Amely

térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv.

Oktáns-szabály alkalmazása (2)

(+) (-) Az atomok túlnyomó

része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez

negatív karbonil sáv tartozik.

Indukált CD

• Királis gazdamolekula vagy kötőhely

(ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS)

• Akirális, kromofór vendégmolekula

(színezékmolekula, hatóanyagmolekula).

• A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet

vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az

e

átmeneteit perturbálja  az akirális molekulának

a királishoz kötődve CD-jele indukálódik.

Indukált CD

cisz-parinársav (kromofór,

akirális vendégmolekula) -laktoglobulin

(királis host, látható tartományban nincs elnyelése)

Indukált CD

2 db akirális festékmolekula

kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún.

exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula

kötödik egy

fehérjekötőhelyen).

Egyre több

festékmolekulát

hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált CD jel (egyre több festékmolekula

kötődik a fehérjén). A CD jel az akirális festékmolekula elnyelési

Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata

• Környezeti változások (pH, hőmérséklet stb.) → konformációs változás

• CD spektrum alakja érzékenyen tükrözi a fehérje konformáció változásait.

• A CD spektroszkópia jól használható (denaturációs vizsgálatok,

Másodlagos szerkezet

• Fehérjék esetében a távoli UV tartományban

(180nm - 260nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet.

• 190-240 nm közt a CD spektrum az amid

csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha más a másodlagos szerkezet, más a CD spektrum.

Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma

-hélix

rendezetlen

szerkezet -redő

-turn

Lineárkombináció

-hélix

-redő

















Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja

Illesztés

Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék.

A ribonukleáz hődenaturációja

• Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A, (0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on.

• Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222nm-en).

-30 20

-20 -10 0 10

184 200 220 240 250

CD

Wavelength[nm]

-12 -5

-10 -8 -6

10 20 40 60 80

CD

Temperature[C]

-hélix

rendezetlen szerkezet

Köszönöm a figyelmet!