A DNS Szekvenálás
2008
Géntechnikák labor
Bevezetés
• Restrikciós enzimek / restrikciós térképek
• Genom könyvtárak
• Fehérje aminosavsorrend meghatározás
• Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok)
• Direkt szekvenálás
– Egyféle termék
• Klónozott PCR termék
– Többféle termék
– Egymásra rakódó szekvenciák – Klónozás plazmidba
Módszerek
• Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció
– 5’ radioaktív izotópos jelölés (32P) – Bázis specifikus hasító reakciók – Elektroforézis, autoradiogramm – Mérgező anyagok, négy reakció
• Sanger-féle enzimatikus módszer
– Automatizálható!!!!!
– Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb mennyiségű is kimutatható
– Egy reakcióban is megoldható
– Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok – PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben
A reakcióelegy:
• Templát
• Oligonukleotid primer
• DNS polimeráz
• Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
• Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
O N
N N
O
N N O
O N
N O O
O N
N N
N O
N O
N O
O
O O O
N N
O
O
O N
N O
O N
N N
N O
N O O
O O
N N
O
O O N
N N
N N O
P O O
O
P O O
O
P O O
O
P O O
O P O
O O
P O O
O P O
O O P
O O
O
A szekvenálás
• Denaturáció
• Anelláció
– Egy primer
• Elongáció
– Véletlenszerű lánc termináció
A szekvenálás menete
O O N
N O
O N
PO O
O N
N N
O
N N O
O P
O O
O N
N N
O
N N O
O PO O PO
O O
O N
N N O
N O
N O
O O N
N O
O N
PO O
O
O O
N N
O O PO
O O
Elválasztás
• Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm)
– Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség
→ nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira – Kis feszültség: szebb elválasztás
• Poliakrilamid mátrix
– Betöltés: nagynyomású nitrogén – nagy felbontás
• Minta bejuttatása
– Elektrokinetikus injektálás
– Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak!
– Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség
Detektálás
• A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd mérjük a fluoreszcenciát
• Fluoreszcensen jelölt primer
– Négy reakció
– Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid – Négy futtatás
• Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok
– Egy reakció – Egy futtatás
– Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható
Kiértékelés
• A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít, a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik.
– Szekvencia ellenőrzés!!!!!
• Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi
• Kiértékelési hibák
• Kimaradt betűk
Szekvenciák összehasonlítása
• Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és összehasonlítani az eredményeket.
• Összehasonlításhoz ingyenes internetes
szoftverek. (Clustal, Multalin)
TTV típusok genomjának összehasonlítása (Multalin)
Irodalomjegyzék
• Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia
• Multalin ( http://ribosome.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html )
