A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Három fő csoport
1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete
A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése
I típus
Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en (~1000-5000 bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja,
nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén.
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK II típus
Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében
pl. Eco RI
Mg2+ kell
Ez a típus az elterjedt
III. típus
I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja
egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Enzim Felismerőhely hossza
Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus
AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus
HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus
EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli
BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens
Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)
5' túlnyúló
SalI 6 Streptomyces albis
3' túlnyúló
5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3'
Palindrom példák
KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA
RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT
NEM KERESIK
Isoschisomers
AtcI 6 5' GGTAC/C 3'
KpnI 5' GGTAC/C 3'
XmaI 6 5' C/CCGGG 3'
SmaI 5' CCC/GGG 3'
Kompatibilis véget adó enzimek
SalI 6 5' G/TCGAC 3'
XhoI 5' C/TCGAG 3'
FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK
AfIII 6 5' A/CPuPyGT 3'
DNS METILÁZOK
- dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)
5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez
N N
N N
N
adenin
sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI, egyenként ellenőrizni kell,
érzékenység esetén - dam- törzs használata
- nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)
-dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz)
5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez
N N
O N
citozin - hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny
enzimek
- megoldás ugyanaz, mint a dam esetén
Sok metiláz van még,
hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz
METILÁCIÓ FÜGGŐ RESTRIKCIÓS RENDSZEREK
- mrr 6 metiladenin esetén - mcrA m5CG szekvencia kell - mcrB Pum5C esetén
METILÁZOK FELHASZNÁLÁSI TERÜLETE:
-DNS védelem hasítások ellen
- laza specificitású helyek specificitás növelése
(ha az egyik szekvencia tartalmazza a metiláz felismerő szekvenciáját (pl. HincII: GTPyPuAC, amiből GTCGAC a TaqI metiláz felismerőhelye, HincII metiláz érzékeny
- metiláció függő restrikciós helyek előállítása
Polimerázok
- DNS függő DNS polimerázok - RNS függő DNS polimerázok
- Templátfüggetlen DNS polimeráz - DNS függő RNS polimeráz
5’ 3’ polimeráz aktivitás
DNS függő DNS polimerázok
DNS jelölés, nick transzláció
denaturálás
N: A,C,G,T (NNNNNN)
