Prof. Prohászka Zoltán
egyetemi tanár, az MTA doktora
Tisztelt Professzor Úr!
Mindenekelőtt szeretném megköszönni Önnek, hogy elvállalta és elkészítette értekezésem bírálatát. Köszönöm építő jellegű kritikáit és észrevételeit, melyekre a következő válaszokat adom.
Részletes bírálat, kérdések
1, Az uPA és a PAI-2 haze kialakulásában játszott szerepével kapcsolatos kérdések:
Az új eredmények (6.1. szakasz) között a következő állítás szerepel: "... a komplikált sebgyógyulás (haze)....szerin proteáz inhibítor alkalmazásával indukálható". Nem találtam a doktori műben ezzel kapcsolatos eredményeket vagy elemzést.
Az ide vonatkozó eredmények a 4.1.1 alfejezetben kerültek bemutatásra, a könnyebb áttekinthetőséget a 3. táblázat és a 11. ábra segítik. A táblázat összefoglalja a PRK kezelést követően alkalmazott protokollokat és a kezelés függvényében a késői posztoperatív (1-6 hó) időszakban kialakult corneális haze jellemzőit. A 11. ábra bemutatja a könnymintákban mért urokináz típusú plazminogén aktivátor (uPA) aktivitás csökkenést, az első posztoperatív héten alkalmazott szerin proteináz inhibitor (aprotinin) kezelés vonatkozásában. A 4.1.2 alfejezet a szerin proteináz inhibitor urokinázt gátló hatását ismerteti a nyúl szaruhártya sejtjeire, az eltávolított epiteliális sejtrétegben mért uPA expressziójának szemléltetésével (12. és 13- ábra). A vonatkozó megbeszélést az 5.1.1 és 5.1.2 fejezetek tárgyalják.
A doktori műben a nehezebb áttekinthetőséget az okozhatta, hogy a dolgozat elején definiálásra került a specifikus szerin proteináz inhibitor, aprotinin alkalmazásának megnevezése, majd a későbbiekben a hatóanyag került megnevezésre. Az előadásban a könnyebb érthetőség végett erre különös figyelmet fordítok.
Az 51. oldalon a szövegben szerepel, hogy az aprotininnal kezelt állatszemek esetében haze kialakulása volt megfigyelhető, azonban a hivatkozás a 11. ábrára történik, amely az uPA aktivitás posztoperatív kinetikáját mutatja (és nem a haze kialakulásának arányát).
A disszertáció ezen paragrafusa:
„Szerin proteináz inhibitor (aprotinin) alkalmazása az első posztoperatív héten alkalmasnak bizonyult az állatok könnyében mért uPA aktivitás értékeinek visszaszorítására”. Ezen eredményeket szemlélteti a 11.ábra.
A paragrafus következő mondata visszautal a 3. táblázatban már megszerzett ismeretekre, miszerint „Az aprotininnal kezelt állatszemek estében haze kialakulása volt megfigyelhető a késői posztoperatív időszakban”.
Szintén nem találtam olyan eredményt, ami az új eredmények között felsorolt következő állítást támasztaná alá: "A haze kialakulása...szignifikánsan csökkenthető uPA lokális (szemcsepp) pótlásával." Az erre vonatkozó táblázat a 187-es sorszámon felsorolt cikkben megtalálható, miért nem kerültek be ezek az eredmények a doktori műbe?
A 187-es referencia eredményei bekerültek a doktori műbe, de sajnos a referencia számban hibásan 190-ként hivatkozottan (3. táblázat és 11. ábra), ezért ezúton is elnézést kérek. A mű megértését valóban tovább segítette volna a Professzor Úr által hiányolt (187-es referencia) 2004-ben publikált Invest Ophthalmol Vis Sci közlemény megbeszélés fejezetét képező 2. táblázat beillesztése, melyet az előadásomban pótlok.
2, Az uPA és a PAI-2 hatásával kapcsolatos kérdés: a 6.1-es "Új eredmények" pontban felsorolt összefoglalás szerint mind az uPA (szemcsepp), mind a rekombináns PAI-2 (szemcsepp) hatására csökkent a haze kialakulásának rizikója vagy súlyossága. Az uPA hatása a plazmin aktivitásának fokozása, míg a PAI-2 a plazmin inhibitora. Kérem oldja fel ezt a látszólagos ellentmondást, ami abból adódik, hogy a plazmin aktivitásának fokozása és csökkentése is azonos irányba ható biológiai választ okoz eredményei szerint!
A szaruhártya sebgyógyulási folyamatait két nagy rendszer szabályozza aktivátorok és inhibitorok útján. A plazminogén aktivátor-plazminrendszer a degradációért és a károsodott extracelluláris mátrix eltakarításáért felel, míg a másik rendszer, az aktivált keratociták révén a károsodott kollagén struktúrák helyére újonnan szintetizálandó kollagén fibrillumok létrehozásáért. A két rendszer harmonikus működési egyensúlya elengedhetetlen a szaruhártya sérülését követő reepitelizáció szempontjából.
A plazminogén aktivátor-plazminrendszer egyensúlyának felborulása a szaruhártya sebgyógyulási folyamatait két irányba tolhatja el: egyrészről a szaruhártya hegesedése, másrészről elhúzódó sebgyógyulás, esetenként szaruhártyafekély kialakulásához vezethet (ezen két állápot került górcső alá).
A látszólagos ellentmondás tehát abból fakad, hogy míg az első állítás egészséges, refraktív műtéten átesett szaruhártyákra vonatkozik, az ellentétes állítás pedig vegyileg sérült szaruhártyákra/szaruhártya fekélyre.
• Az új eredmények 6.1 alfejezetének első két alpontjai megállapítása az egészséges szaruhártya sebgyógyulási folyamatainak vizsgálatával szerzett ismereteinkre vonatkozik, refraktív lézerkezeléseket követően. A lézerkezelés hatására a szaruhártya elülső stróma mátrixának szerkezete, valamint sejtjeinek sűrűsége és fenotípusa is megváltozik, minek következtében csökken a szöveti transzparencia és corneális strómahomály (haze) alakulhat ki. Szerencsére az esetek jelentős részében a szöveti transzparencia csökkenés nem ölt klinikailag szignifikáns mértéket. A haze kialakulása mögötti pontos mechanizmusok mind a mai napig nem ismertek pontosan és feltételezhető az egyének közötti varianciák jelentős szerepe is, melyek a könny biokémiai összetevőiben is megfigyelhetőek. Mind humán megfigyeléseink, mind állatkísérleteink eredményei azt bizonyították, hogy a normál (egészséges) corneán ejtett refraktív sebészeti beavatkozásokat követően az uPA szintje a korai posztoperatív szakban jelentős mértékben megemelkedik a könnyfilmben, melynek elmaradása haze kialakulását eredményezi. Állatkísérletben alkalmazva a lokálisan alkalmazott uPA pótlása a könnyben a haze kialakulását szignifikánsan csökkentette. A mechanizmus hátterében elsődlegesen az alábbi biokémia folyamatok állhatnak:
o a szaruhártya sérülésének következtében uPA szabadul fel, mely a sebgyógyulás szempontjából hasznos és kívánatos
o az uPA biokémiai kaszkád folyamatokat indít el, így szerepet játszik mind a szövetek pusztulásában, mind azok helyreállításában [részletesen lsd. megbeszélés 5.1 alfejezet].
• A 6.1.-es alfejezet 3. alpontja miszerint a rekombináns plazminogén aktivátor inhibitor -2 (PAI-2) szemcsepp alkalmazásával csökkenthető a haze súlyossága, nem egészséges, hanem vegyi sérült corneákra vonatkozik.
Vegyi sérülés során a könnybe nagyobb mennyiségű uPA kerül(het), a szaruhártya és a kötőhártya epitél sejtjeinek károsodása következtében. A kötőhártya permeábilitása is fokozódhat, így proteázok proenzim formái, illetve PAI-ok kerülhetnek a könnybe.
Az uPA képes a könnybe került plazminogént aktiválni, míg a plazma inhibitorok igyekeznek az urokináz aktivitását gátolni. Amennyiben az inhibitor készlet kimerül, a nagy mennyiségű aktív plazmin hatására a könny proteolitikusan aktívvá válik. A plazmin indukálta szignalizációs hatás a monociták, makrofágok és egyéb gyulladásos sejtek funkcióira is hatást gyakorol. A képződő nagy mennyiségű széles szubsztrát specifikus aktív plazmin már nem csak a fibrint, hanem az intakt kollagén kivételével az extracelluláris mátrix fehérjéit is képes hasítani. Az aktív kollagenáz szövetkárosodást, a szaruhártya állományának proteolitikus lebontását eredményezheti, így meghatározó szerepet játszik a szaruhártya fekély kialakulásában. Az irodalomban ismert (Cejková J. és mtsai, 1993) a könnyfilm plazmin koncnetrációjának és az ulceratív folyamat súlyosságának korrelációja.
Magas plazmin aktivitás esetén tehát, a sebgyógyulási folyamat elősegítésére a fentiek ismeretében logikus, és állatkísérletek is bizonyítják a lokálisan alkalmazott plazmin inhibitorok hatásosságát.
3, Az adatok bemutatásával és elemzésével kapcsolatos kérdések
A corneális rekonstrukciós műtétekkel kapcsolatos kísérletek bemutatásánál (4.1 fejezet) számos esetben átlag és szórás értékekkel táblázatban (vagy oszlop diagrammon) mutatja be az eredményeit. Sok esetben nincs feltüntetve a csoportok elem/esetszáma.
A 4.1. fejezet esetszámai az alábbiak:
4.1.1. alfejezet (3. táblázat és 11. ábra)
o 187. hivatkozás: Invest Ophthalmol Vis Sci (2004); 30 nyúl 60 szem
továbbá
o 193. hivatkozás: Exp Eye Res (2003); 8 nyúl 16 szem 4.1.2. alfejezet (12-14. ábra)
o 187. hivatkozás: Invest Ophthalmol Vis Sci (2004) lsd. fent továbbá
o 41. hivatkozás: Curr Eye Res (2010); 22 nyúl 44 szem 4.1.3. alfejezet (4., 5. táblázat és 15. ábra)
o 190. hivatkozás: J Cataract Refract Surg (2008); 46 PRK kezelésen átesett szem és 13 LASIK kezelésen átesett szem
4.1.3.1. alfejezet (16-19. ábra és 6. táblázat) o 205. hivatkozás: IJOES 2015;
A könnyminták inhibitor méréseire vonatkozó adatok:
19 állapotos páciensünk 56 könnymintájából végeztünk PIA-2 meghatározást, 13 állapotos páciensünk 45 könnymintájából végeztünk PIA-1 meghatározást,
A vérminták inhibitor, osztrogén és progeszteron méréseire vonatkozó adatok:
A vérminták vonatkozásában 25 állapotos hölgy 87 mintáinak méréséből történt PAI-2, 10 állapotos hölgy 20 mintájából PAI-1 és 17 állapotos hölgy 51 mintájából történt osztrogén és progeszteron meghatározás.
o PLOS One (2017); a könny uPA méréseire vonatkozóan a vizsgálatban résztvevő gravidák adatait (gesztációs hét, résztvevők száma) a 6. táblázat tartalmazza. A nehéz érthetőséget sajnos a referencia ábráról történt lemaradása okozhatta: A. Csutak, Z. Steiber, J. Tőzsér, A. Jakab, A. Berta, D.M. Silver. Plasminogen activator activity in tears of pregnant women. PloS One. 12(5): e0177003, 2017.
4.1.4. alfejezet (20-22. ábra és 7-8. táblázat) o 207. hivatkozás: MSZH, Budapest, 2007;
Az A és B csoport egyaránt 6 új-zélandi fehér nyulat foglalt magába.
Továbbá, pl. 7-8. táblázat (és 21-22. ábra is?) esetén az átlag standard hibáját tünteti fel, nem is a szórást.
Valóban így van, a 7-8. táblázat az „Átlag ± standard hiba” értéket (Mean ± standard error) adják meg. A 21-22. ábrák szintén az „Átlag ± standard hibá”-t használják. Az SD érték könnyen megkapható, mivel SD = SEM x √N, ahol N a minta mérete (lsd.
207. hivatkozás).
A szórás (és máskor a SEM) esetenként (pl. 15. ábra) olyan nagy, hogy már pusztán ebből a tényből is kiolvasható, hogy nem normál eloszlású mintához tartozik.
A szórás (SD) az adatok eloszlásának mértékét mutatja az átlaghoz képest. Az alacsony szórás azt jelenti, hogy az adatok az átlag köré csoportosulnak, a nagy szórás pedig azt jelzi, hogy az adatok jobban el vannak oszlatva. A magas SD nem jelenti azt, hogy az adatok nem mutatnak normál eloszlást. A minták normális eloszlását a normál halmazból származó maradékok elemzésével lehet vizsgálni [Bland M. The normal distribution. In: An introduction to medical statistics. 2nd Ed. Oxford: Oxford University Press; 1995. pp. 101±118.]. Például, a 15. ábrán a posztoperatív PRK-nak megfelelő adatok normál görbéje R2 = 0,941-et eredményez, ami az adatok normál halmazhoz való maradék illeszkedésének mértéke. A posztoperatív LASIK érték: R2 = 0,944. Így mind a posztoperatív PRK, mind posztoperatív LASIK adatai normál eloszlást mutatnak.
A 60. oldalon a könnymintákban mért uPA aktivitás leírása során az eloszlás bimodális jellege miatt az adatait két csoportra bontotta az elemzéshez (mérhető és nem mérhető aktivitás). Elképzelhető, hogy a 4. táblázatban bemutatott könny PAI-2 szintek is bimodális eloszlásúak voltak (pl. műtét előtt csoport n=41, átlag 19,8, SD 23,4, min. 0), és előfordultak mérhetetlenül alacsony szintek?
A PAA mérések két kategóriába sorolhatók:
o egyik csoport: a mért PAA érték nem nulla o másik csoport: van nulla mért PAA érték
Az adatokat két csoportra bontva vizsgálva látható, hogy a két csoport különböző PAA mintázatokat mutat a terhesség alatt. Ez képezi a 60. oldalon leírt kutatás lényegi konklúzióját. A 4. táblázatban feltüntetett adatok megfelelnek a 15. ábrának, ahol az adatok normál eloszlású mintákhoz tartoznak (lsd. fent) -nem bimodális eloszlásúak- annak ellenére, hogy egyes mérések PAI-2 értéke nulla volt.
Ha volt ilyen csoport, azonos következtetéseket vontak volna le, ha ezeket az adatokat is (helyesen) elkülönített csoportokban vizsgálják, hasonlóan az uPA analízishez?
Annak ellenére, hogy a 4. táblázatban és a 15. ábrán leírt adatok normál eloszlásúak (nem bimodálisak) az adatok két kategóriába történő sorolása megengedett:
o egyik csoport: a mért PAI-2 értéke nem nulla
o másik csoport: legalább egy esetben nulla a mért PAI-2 érték
Az alábbi A ábra a disszertáció ábrája, a B ábra pedig azt az elemzési eredményt mutatja, amikor az adatokat két csoportra osztva vizsgáljuk meg: nem-nullára és nullára. A B ábrát összevetve az A ábrával ugyanazt a mintázatot láthatjuk, mind a PRK, mind a LASIK kezelés vonatkozásában. Ez a mintázat képezi a kutatásban levont következtetések alapját. A fentiek alapján a levont következtetéseinken nem változtat az, hogy a PRK és a LASIK adatai két-két külön csoportra vannak-e osztva vagy sem.
A ábra (disszertáció ábrája)
B ábra (újonnan készített ábra)
További észrevételek
Nem világos, hogy a 3. táblázatban a "haze" oszlopokban szereplő számok pontosan mit takarnak. A táblázat címe "kezelést követően kialakult haze", míg az eredeti cikkben "haze
PRK -NEM NULLA PRK - NULLA LASIK - NEM NULLA LASIK - NULLA
grade" szerepel. A doktori műben nem találtam pontos leírást a haze súlyosságát értékelő pontrendszerről, pedig ezek az eredmények fontos részét képezik a műnek. Hivatkozás történik Hanna 1960-as cikkére, utána olvasással megállapítható, hogy egy 5 fokozatú pontskála kerülhetett alkalmazásra. Ezt a skálát változtatás nélkül használták? A 7-8. táblázatok esetében is hasznos lett volna utalás, vagy rövid leírás, hogy mit is jelentenek az adott pontértékek. A 7. és 8. táblázatokban szintén átlag és standard hiba értékek szerepelnek, ami megkérdőjelezhető egy 5 értékű ordinális változó esetén. Nem próbálták megismételni az elemzést úgy, hogy a változót kategórikusnak tekintették (Chi-square test for trend)?
A haze Hanna-féle 5 fokozatú skáláját változtatás nélkül intervallumskálaként kezeltük, amelynek elemei - definíció szerint - olyan diszkrét változók, amelyek feldolgozás szempontjából folytonosnak tekinthetők. Ezáltal tehát a középértékek közül mind a helyzeti középértékek (a módusz és a medián), mind a számított középértékek, így a számtani átlag is számítható és értelmezhető. Mivel a khi négyzet próba rendkívül érzékeny a minta elemszámára (azaz ugyanazon jelenség elemzésekor előfordulhat, hogy kis mintanagyságnál nem jelez szignifikáns kapcsolatot, míg nagyobb elemszám esetén igen), így nem kíséreltük meg elemzésünk ismétlését a teszttel.
Tisztelettel kérem válaszaim elfogadását!
Dr. Csutak Adrienne PTE, egyetemi tanár
Pécs, 2021. szeptember 30.
