Általános Genetika
A génműködés szabályozása
eukariótákban
Genomi ekvivalencia
A fejlődésgenetika paradigmája: differenciális génkifejeződés Morfogén grádiensek
A differenciált génaktivitás fenntartása – mestergén - génhierarchiák
Dolly (1996)
Differenciált szomatikus sejt (emlőszövet) sejtmagja
Enukleált petesejt
Hormonálisan felkészített álvemhes nőstény
Többsejtű szervezetek differenciált sejtjeinek genetikai anyaga nem szenved olyan irreverzibilis változást, mely megakadályozná egy új egyed fejlődésére vonatkozó program végbemenetelét.
2
Genomika, Rendszerbiológia
Komplexitás: gének száma – sejttípusok száma (?)
- a humán genom 98%-a nem kódol fehérjét – „hulladék” lenne?
de
- a humán genomnak körülbelül a 80%-a átíródik RNS-re Saccharomyces cerevisiae kb. 6000 gén
Ember ~ 20000 fehérjekódoló gén
~23000 nem fehérjekódoló gén (RNS-termék) > több (?)
~14000 ún. pszeudogén (a fehérjekódoló génekhez hasonlóak, de az evolúció során felhalmozódott mutációk következtében nem funkcióképesek)
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable.
Interaktóm
A génkifejeződés szabályozásának szintjei:
A DNS > mRNS > fehérje útvonal számos lépésénél 1. Transzkripcionális
2. Szelektív RNS érés 3. Alternatív splicing 4. mRNS transzport 5. Transzláció
6. mRNS degradáció 7. fehérjeaktivitás
4
két tényező összjátéka:
transzkripcionális faktorok (transzkripciót szabályozó fehérjék) hatása
strukturális sajátságok (a DNS „csomagoltságának” mértéke)
Transzkripcionális szabályozás
Az eukarióta transzkripció jellemzői:
a transzkripció és a transzláció külön térben, egymástól jól elválasztva zajlik
háromféle RNS-polimeráz: pol-I, pol-II, pol-III van jelen
a transzkripció szabályozása jelentős részben aktiváló jellegű: a promóter és az RNS-polimeráz önmagában nem elég a transzkripció elindításához
a kromatinszerkezet gátolja a transzkripciót
transzkripciós egységenként egy fehérjekódoló szakasz jellemző (monocisztronos mRNS), az operonok igen ritkák
az mRNS érési folyamatokon megy keresztül, mielőtt kijutna a sejtmagból
Transzkripcionális szabályozás
6
Az RNS polimeráz II promótere
A magpromóter: több konszenzus szekvenciát tartalmaz
Gyakran a transzkripciós starthely környékén és ettől 3’ irányban is található egy konzervatív szakasz
TATAAAA YYANT/AYY RGA/TCGTG
G/CG/CG/CCGCC
Promóter mögötti elem iniciátor elem
TATA box TFIIB elem
+30 +1
-35 -25
Transzkripciós starthely 5’
3’
Y=pyrimidine, C, U R=purine, A, G
Cisz módon ható regulátor elemek (a transzkripciót szabályozó DNS-szakaszok)
Az RNS polimeráz II promótere
Cisz módon ható regulátor elemek (a transzkripciót szabályozó DNS-szakaszok)
A szabályozó promóter (promóter proximális elemek) közvetlenül a magpromóter előtt helyezkedik el, szekvenciája nem szigorúan meghatározott, gyakran CAAT és GC gazdag szigeteket tartalmaz.
8
A promóter szabályozó
részében aktivátor kötő helyek
egyedi kombinációja található.
Távolból ható cisz regulátor elemek: enhanszerek és silencerek
Enhancerek
A gén maximális aktivitásához járulnak hozzá
UAS (upstream activator sequences) elemek – élesztőben enhanszer típusú szabályozó szakaszok neve, csak upstream
Magasabbrendűeknél „bárhol”, akár több kbp távolságra a magpromótertől Hatásuk orientációtól független
Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék a DNS kihurkolódása révén kerülnek kapcsolatba az alap transzkripciós apparátussal, vagy a szabályozó
promóterhez kötődő fehérjékkel
Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék magukhoz vonzhatnak kromatin szerkezetet befolyásoló (átépítő, fellazító) koaktivátor fehérjéket is
10
Az enhancerek a környezetük minden promóterére képesek hatni, hatásukat inzulátor szakaszok (határoló DNS-elemek) korlátozzák
Bizonyos inzulátorok a kromatin konformáció változás továbbterjedését akadályozzák meg.
Silencerek
transzkripciót gátló távoli cisz elemek
A silenceren keresztül ható szabályozó fehérjék gátolják a transzkripciót.
12
Egy stimulus egyszerre több gén működését is képes szabályozni
Pl. hőstressz, nehézfémstressz, hormonhatás következtében összehangolt génexpresszió változás tapasztalható
A közösen szabályozott gének közös cisz szabályozó elemekkel rendelkeznek
Ezeket a jól definiált cisz szabályozó szekvenciákat válasz elemeknek (response elements, RE) nevezik
A szabályozó promóter vagy az enhancer régiókban helyezkednek el Néhány példa:
hősokk válasz elem – HRE ösztrogén válasz elem – ERE glükokortikoid válasz elem – GRE fém válasz elem – MRE
Összehangolt génszabályozás
14
Transz regulátor elemek: a transzkripciós faktorok Transzkripciót szabályozó fehérjék
A cisz szabályozó elemekhez kapcsolódva befolyásolják – fokozzák vagy mérséklik - a génátírást
A TF-ek száma élesztőben körülbelül 300, emberben körülbelül 1800
Egy gén szabályozásában a TF-ek különféle kombinációi vesznek részt, ami a genetikai válaszreakciók számát óriásira növeli
A transzkripció hatásfokát a génen ható összes TF együttes hatása szabja meg A TF-ek által felismert DNS-szekvencia motívumok rövid, 6–10 bp hosszúságú szakaszok.
A DNS egy szakaszának 3D szerkezete a TF-ek számára hasznosítható információt rejt: a bázisok szélei a DNS nagy árkában felismerhetők.
A TF-ek kulcsfontosságúak egy szervezet fejlődése során, egy TF-gén deléciója gyakran súlyos fejlődési
rendellenességekhez vezet
A transzkripció megkezdése transzkripciós faktorokon (TF) múlik
RNS polimeráz + alap (basal) transzkripciós faktorok
= alap transzkripciós komplex Az alap transzkripciós komplex a mag promóterhez kötődik
> alacsony, alap szintű transzkripció kezdődik a génről A magasabb szintű transzkripciót aktivátor fehérjék biztosítják
> a szabályozó promóterhez és az enhanszerekhez kötődve
16
Transzkripciós aktivátorok, koaktivátorok és mediátorok
A transzkripciós aktivátor fehérjék vagy közvetlenül, vagy koaktivátor fehérjéken keresztül kapcsolódnak az alap transzkripciós komplexhez. A kapcsolat stabilizálja és aktiválja a komplexet
Az aktivátor és koaktivátor fehérjék egy részének acetiltranszferáz aktivitása van,
amivel befolyásolják a kromatin szerkezetét.
Represszorok
Az eukarióta represszorok hatása:
- nem az RNS polimeráz működés közvetlen akadályozása, mint prokariótákban 1. versenyeznek az aktivátor fehérjékkel a kötődésben, de maguk nem aktiválnak 2. destabilizálják az alap transzkripciós komplexet
18
A TF-ek kapcsolatba lépnek egymással és az RNS-polimerázzal.
Gyakoriak a homo- vagy heterodimerként funkcionáló TF-ek.
A TF-ek moduláris szerkezetű fehérjék, s az alábbi domének kombinációit hordozhatják:
• DNS-kötő domén, mely által a DNS specifikus szakaszaihoz kötődnek
• fehérjekötő domén, mely által kapcsolatot teremtenek más TF-ekkel, vagy az RNS-polimerázzal
• a kromatinszerkezetet befolyásoló domén
• a különféle fiziológiai hatásokat érzékelő domén (például hormonkötő domén a nukleáris hormonreceptoroknál, melyek valamely hormon kötésével aktív transz- kripciós faktorként működnek)
A TF-k szerkezete
A transzkripciós faktorokat a DNS-kötő domén szerkezete alapján négy fő cso- portba, funkcionális szempontok szerint pedig számos családba sorolják.
20
AnimalTFDB
Animal Transcription Factor Database – állati szervezetek TF-adatbázisa
http://www.bioguo.org/AnimalTFDB
Az adatbázis jelenlegi tartalma: 72 család, körülbelül 66000 tag
PlnTFDB
Plant Transcription Factor Database – növényi szervezetek TF-adatbázisa
http://plntfdb.bio.uni- potsdam.de/v3.0/
Az adatbázis jelenlegi tartalma: 84 család, körülbelül 26000 tag
22
A specifikus szabályozó transzkripciós faktorok egyedfejlődési szakasztól, sejttől, szövettől, időtől és más tényezőktől függő jelenléte, illetve aktivitása teszi lehetővé, hogy csak a meghatározott helyen és időben íródjon át magas szinten az adott gén.
Egy gén szövetspecifikus transzkripciója a
szabályozó transzkripciós faktorok jelenlététől és aktivitásától függ
Mi befolyásolja az adott sejt aktív transzkripciós faktor populációját?
A transzkripciós faktorok kifejeződése és aktivitása is szabályozódik.
Transzkripcionális szabályozás:
Génszabályozási hierarchiák, csúcsán a mestergén Morfogén gradiensek
Továbbá:
• foszforiláció–defoszforiláció általi poszttranszlációs aktivitás szabályozás
• tiol-diszulfid redox átalakulás
• az alternatív splicing is vezethet aktív vagy inaktív TF formákhoz (lásd a Drosophila ivarmeghatározási rendszere)
• a hormon-receptor komplex kialakulása
(például az intracelluláris szteroid receptoroknál)
24
Gal4
Az aktivátor fehérjék tipikus példája az élesztő Gal4 fehérjéje
Az élesztő galaktóz hasznosításában résztvevő gének működésében fontos szerepet játszik a Gal4.
Több zink-ujj domént tartalmaz, amin kereszül nagy affinitással kötődik egy jellegzetes DNS sorrendhez, amit UAS
G-nek (upstream activator sequence)
neveznek. UAS
Genhancer sajátosságokkal rendelkezik, aktiváló hatása távolságtól
és irányultságtól független.
Galaktóz hiányában a GAL4 fehérje kötő doménjéhez a GAL80 fehérje kapcsolódik.
GAL80 fehérje megakadályozza a GAL4 aktiváló hatását.
A galaktózt egy GAL3 nevű fehérje köti meg, ami ebben a formájában GAL80-ra hat úgy, hogy az elveszti affinitását a GAL4 iránt. A GAL4 ekkor aktiválja az UASG-vel
rendelkező géneket.
Élesztő kéthibrid rendszer alapja a Gal4 (yeast two-hybrid system)
26
Epigenetikai szabályozás
a DNS-szekvencia „felett, kívül” álló genetikai jelenségek mitotikusan, vagy akár meiotikusan is átörökíthetőek
Epigenetikai szabályozás = az epigenetikai tulajdonságok megváltozásával járó génexpressziós szabályozás
Epigenetikai jelenségek:
1. a kromatin szerkezetét meghatározó hisztonmódosulások 2. a DNS-metilációs mintázatok
epigenom
epigenetikai kód
A kromatinszerkezet befolyása a génkifejeződésre
Az eukariótákban a DNS kromatin szerkezetbe ágyazott.
A kromatin szerkezet gátolja a génkifejeződést azáltal, hogy a transzkripciós faktorok és az RNS polimeráz nem fér hozzá a DNS-hez.
Az eukarióta gének „alap- értelmezett” állapota ezért a kikapcsolt állapot
28
A kromatin szerkezet befolyása a génkifejeződésre
A transzkripció előfeltétele a kromatin fellazulása.
A transzkripciót befolyásoló kromatin változások:
a) hisztonok módosulása, nem kanonikus hisztonok beépülése b) nukleoszóma átépítés (chromatin remodeling)
c) DNS metilálás
30
a) Hiszton módosítás
A nukleoszómákban a negatívan töltött DNS-hez a hisztonok pozitívan töltött farka (Lys, Arg)
elektrosztatikus kölcsönhatással kapcsolódik.
Hiszton acetilezés:
- ált. a lizin oldallánc amino csoportját érinti >
jelentősen csökkenti a hiszton farok pozitív töltését - fokozza a transzkripciót
- acetiltranszferáz enzimaktivitás eredményezi, deacetiláz enzimaktivitás távolítja el
A kromatinszerkezet befolyása a génkifejeződésre
Példa:
A lúdfű virágzását többek között az FLC és az FLD (flowering locus C és D) szabályozza. Az FLC gátolja a virágzást, az FLD pedig FLC-t szabályozza.
A virágzás előtt az FLC gén aktív, területén a kromatin acetilált. Az FLD gén viszont inaktív.
Virágzást kiváltó stimulusra FLD gén bekapcsol. Az FLD deacetiláz enzimet kódol, terméke eltávolítja az acetil csoportokat FLC területén a kromatinról, és evvel kikapcsolja FLC működését. Az eredmény: a lúdfű kivirágzik.
32
Hiszton metilezés
-a lizin -aminocsoportok metilezése
tipikus a H3 4 számú lizinjének (K) metilezése: H3K4me
- leggyakrabban a transzkripciós starthelyek közelében
A hiszton módosító fehérjék DNS-replikáció alatt „helyükön” maradnak, és az új szálon is elvégzik a módosításokat > epigenetikai átöröklődés
(friss eredmény Drosophila-ból)
34
b) Kromatin átépítés (chromatin remodeling)
A hisztonok kémiai módosítása nélkül is megváltozhat a kromatin szerkezete
Pl. SWI-SNF komplex (lsd. korábbi ábrán)
A komplex humán ortológjai tumor-szupresszor gének, hibájuk a sejtosztódás kontrolljának felborulásához vezet
A kromatin átépítés kétféle változást eredményez:
nukleoszóma áthelyezés nukleoszóma fellazítás
36
c) DNS metilezés
- a transzkripcióban inaktív kromoszóma szakaszokon - gerincesekben és növényekben
-a citozinok metiláltak (5-metil-citozin), a metilezettség CG nukleotid párokon, un.
CpG szigeteken fordul elő
5-metil-citozinok mutációs forrópontként viselkednek (l.e.), szelekciós nyomás - a CpG szigetek jellegzetesen gyakoriak a transzkripciós starthelyek környékén - az átíródó szakaszok citozinjai nem metiláltak
- abnormális (például rákos sejtekben) a metilezettségi mintázat szabálytalan - az emlős nőstények inaktív X kromoszómája is erősen metilezett
A metilezett DNS szakaszokhoz jellegzetes fehérjék kötődnek. Ezekhez hiszton deacatilázok is kapcsolódhatnak, melyek tovább stabilizálják a gén inaktív
állapotát.
A CG palindróm magyarázatot ad a metilációs mintázat átörökítésére 38
az egyik szülőtől örökölt allél inaktív
az egyed funkcionális értelemben hemizigóta a génre nézve, a másik szülőtől származó allél mutációja dominánsnak tűnik
Ma száz körüli imprintinget szenvedő gént ismerünk az emberi genomban
Szülői imprinting („bevésődés)
Angelman-szindróma (leírója Harry Angelman után, 1965) - „boldog babák” (jellemző tünetek a nevetés, szaggatott járás)
- a 15. kromoszóma egy kb. 4 Mbp-os szakaszának deléciója (ubikvitin-útvonalban részt vevő UBE3A gén érintett)
-a gén apai imprintinget mutat, az Angelman-szindróma kialakulása az anyai allél deléciójának (az esetek 70%-a) vagy más mutációjának (az esetek 30%-ban) következménye.
Prader–Willi-szindróma
-- a betegek alacsonyak, enyhén szellemi fogyatékosak, izomtónusuk gyenge és kényszeres evők
- szintén a 15. kromoszómán elhelyezkedő egyik gén (SNRPN) funkcióvesztésének eredménye (SNRPN gén terméke az mRNS-splicingban vesz részt)
PEV-fokozó és PEV-szupresszáló mutánsok segítségével egy sor olyan gént azonosítottak a Drosophilá-ban, melyek a heterokromatin kialakulását elősegítik vagy gátolják
PEV – pozíciófüggő variegáció (Müller 1938)
40
Általánosan és nagy mennyiségben előforduló RNS és fehérje molekulák termelődésének szabályozása
folyamatos átíródás
gének ismétlődése (genetikai redundancia)
gének extrakromoszómális amplifikációja
pl. hisztonok, a transzlációs apparátus molekulái, membrán komponensek stb.
pl. rRNS-gének (ember):
öt klaszterben (a 13, 14, 15, 21, 22 kromoszómákon)
összesen 300–400 példányban fordul elő az a transzkripciós egység, melyről a 18S, 28S és 5,8S rRNS keletkezik (lásd még Az eukarióta rRNS-ek érése)
Az 5S rRNS-gének nem a NO (nucleolus organizátor) régió részei, de szintén
klaszterekben helyezkednek el a genomban. Az 5S rRNS gének száma emberben
Xenopus laevis oocyta sejtmagjának elektronmikroszkópos felvétele.
A fekete pöttyök az extrakromoszómális nukleóluszok
Az „elszabadult” extrakromoszomális sejtmagvacskák százai a riboszomális gének gyűrűszerű elrendeződéseiből állnak
42
Poszttranszkripcionális szabályozás:
Differenciális mRNS-érés
differenciális (eltérő helyen történő) poliA farok hozzáadás
a splicing alternatív útjai
Az alternatív splicing lehetővé teszi, hogy a pre-mRNS-ből többféle érett mRNS képződjön.
Ez különböző szövetekben, vagy a fejlődés különböző szakaszaiban különböző fehérjék keletkezését biztosítja ugyanarról a génről.
Az alternatív splicing jól ismert példája a muslica ivar meghatározásával kapcsolatos Ha a muslica embrió sejtjeiben az X :
autoszóma arány 1
TF dimer X és A-n kódolt alegységekből véletlenszerűen képződik
> csak az XX dimer aktív TF (XA és AA inaktív)
a sex-lethal (Sxl) gén promótere bekapcsol (=mestergén)
A hímekben (X:A = 0,5) a Sxl gén promótere nem aktiválódik, nem termelődik Sxl fehérje.
A Sxl fehérje egy másik gén, a transzformer (tra) pre-mRNS-ének splice faktora. A Sxl fehérje hatására a tra gén termékéről aktív, hiányában inaktív fehérje képződik.
Tra fehérje a fejlődést a nőstény, hiánya a
hím fejődési útra tereli.
44A Tra fehérje maga is splice faktor, egy harmadik, a doublesex gén termékének spliceing-ját szabályozza. Tra egy további gén (tra-2) termékével nőstény
specifikus Dsx fehérjét, Tra hiánya hím specifikus Dsx fehérje keletkezését
eredményezi.
RNS lebontás szabályozása
Adott mRNS koncentrációja a citoplazmában nemcsak szintézisének rátájától, hanem stabilitásától is függ
A poliA farkak nélkül az mRNS-ek gyorsan degradálódnak.
A poliA farokhoz kapcsolódó PABP (poliA binding protein) a cap-hez horgonyozza a poliA farkat, és ezzel védi az mRNS 5’ végét.
Az mRNS gyakori 5’→3’ lebontását a poliA rövidítése, majd a cap eltávolítása előzi meg
Az mRNS-ek 3’ UTR-ének szekvenciája befolyásolhatja annak féléletidejét.
mRNS-ek féléletidejének függése a 3’
UTR-ben jelen lévő AUUUA motívum számától
Poszttranszkripcionális szabályozás:
46
Génműködés szabályozása kis RNS-ek által
úgy becsülik a humán gének 30 %-án érvényesül ilyen hatás
transzláció gátlása
mRNS-ek degradációja
transzkripció befolyásolása
si (small interfering, kis interferáló) mi (mikro)
pi (Piwi-interacting)
Rasi (repeat associated)
….
David Baulcombe és csoportja
egy vírus gént kifejező transzgénikus dohány növény rezisztens lett az adott vírussal szemben
ezek a növények rövid, 25 nukleotid hosszúságú RNS-molekulákat termelnek, amelyek komplementerek a vírus genommal
Richard Jorgenson
lila virágú petúnia növénybe vitte be egy saját gén extra kópiáját, a lila pigment termeléséért felelős enzim génjét
a transzgén gátolta a lila pigment termelődését, azaz gátolta a saját és a vele megegyező endogén gén kifejeződését.
Génműködés szabályozása kis RNS-ek által:
az első megfigyelések
48
Andrew Fire és Craig Mello, 1998 Nature
C. elegans féregben szelektíven ki lehet kapcsolni géneket
géncsendesítés (gene silencing): az embrióba injektált dupla szálú RNS-sel (dsRNS)
Pl. a vad típusú féregembriókba injektált unc-22 dsRNS az unc-22 null mutánsokkal megegyező fenotípust (izomdefektet) okozott
az in vitro szintetizált dsRNS az unc-22 gén kódoló szálát (sense) és a komplementer (antisense) szálat is tartalmazta
RNS-interferencia (RNAi) 2006 Nobel-díj
Génműködés szabályozása kis RNS-ek által:
az első megfigyelések
Később kiderült, hogy a bemutatott növényi kísérletekben is dupla szálú RNS váltotta ki a géncsendesítést. A dsRNS úgy keletkezhetett, hogy a transzgének a növényi genomba random épültek be (ez a módszer sajátsága), és a beépülés környezetében lévő belső
50
A mRNS kis RNS függő hasítása
A RISC koplex siRNS-e hibridizál a komplementer RNS-el és a kétszálú szakasz közepén elhasítja.
Ez a „slicer aktivitás”.
A mRNS azután degradálódik.
Ezzel az siRNS csökkenti a mRNS szintjét és végső soron a kódolt fehérje mennyiségét.
52
Slicer független mRNS degradáció
Bizonyos, rövid fél-életidejű mRNS-ek 3’ UTR szakaszán AU gazdag szakasz található.
miRNS kapcsolódik az AU gazdag szakaszhoz, és a mRNS lebontódik.
A folyamatban részt vesz a Dicer és a RISC, de slicer aktivitás nem mutatható ki.
A mechanizmus még nem teljesen ismert.
A transzláció kis RNS függő gátlása A mechanizmus nem ismert pontosan.
Az miRNS mRNS hibriden a transzláció iniciációja gátlódik. A folyamat
hatékonyságát fokozza, ha a mRNS-hez több, különböző miRNS kötődik.
54
A transzkripció siRNS függő csendesítése Az siRNS-ek a kromatin szerkezet
megváltoztatásában is részt vesznek.
Az siRNS RITS (=RNA transcriptional silencing) komplexbe kötődik.
Az siRNS a komplementer DNS sorrendhez köti a RITS komplexet. A RITS komplex a szakaszhoz vonzza a DNS-metiláló enzimeket. A metilált DNS- nél léterejövő tömör kromatin transzkripciója
akadályozott.
Bizonyos géneket a transzlációt befolyásoló vagy fehérjéket módosító folyamatok szabályozzák
A mRNS transzlációjához riboszómák,
aminoacil tRNS-ek, iniciációs és elongációs faktorok mindegyike szükséges.
Az emlősök vírusok elleni immun védelméhez a T limfociták (T sejtek)
nélkülözhetetlenek. A T sejtek a sejtciklus G0 állapotában keringenek. A vírus antigén a T sejtek gyors osztódását, és nagy
mennyiségű (7-10x) immunglobulin termelését váltja ki. Az immunglobulin termelés beindulása nem igényli ezen
fehérjék mRNS szintézisének fokozódását.
A folyamatot az iniciációs faktorok hozzáférhetősége szabályozza.
Az inzulin okozta fehérje szintézis fokozódás során ugyancsak az inaktív formában lévő
transzlációs iniciációs faktorok aktiválódnak.
A folyamat foszforilációval valósul meg. 56
