Oligonukleotid szintézis

Oligonukleotid szintézis

Mintegy 50 éves múlt

5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter Foszforamidit, H-foszfonát

Szilárd fázisú szintézis:

hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol Mind DNS mind RNS szintetizálható

mind a két módszerrel

Oligonukleotid szintézis: monomerek

2% DCA/DCM

di-MeO Tr

I2 / H2O

N

tetrazol

< 1 % Ac2O

> 99 % újabb ciklus

O O

B2

di-MeO Tr O O

O

B2

O O

O AcO

hordozó B1

di-MeO Tr O

O O O

hordozó B1

O O

O O

H

hordozó

B1

di-MeO Tr O

O O O

NC P

O N

B2

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer

O O

O O

H

hordozó B1

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer, alternatív kép

O O

O O

H

OSi

hordozó

B1

di-MeO Tr O O

O O O P H

O

OSi B2

di-MeO Tr O O

O O

P

O H

OSi B2

O O

O O

OSi

hordozó

B1

di-MeO Tr O O

O O

P

O O

OSi B2

O O

O O

OSi

hordozó

B1

Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER

Egy-két automata szintetizátor

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I.

- Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás

A lúg hatására lehasad:

- védőcsoportok a bázisokról

-  -cianoetil csoport a fosztátról

- oligo a hordozóról

- méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges)

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II.

Ioncserés kromatográfia Hidrofób kromatográfia a DMT csoporton keresztül - kvantitálás bázis (µmol * cm/cm³)

dA 15.4

dG 11.7

dC 7.5

dT 8.8

átlagosan



OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK

- primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele

- adapterek: különböző (nem-kompatibilis)

ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika

- antiszensz oligonukleotidok, génterápia   - gén darabok

  - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

Linkerek

rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálva olyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egy

tetszőleges restrikciós endukleáz felismerő helyét:

Restrikciós hely bevitelére alkalmas

BamHI...CGGATCCG EcoRI...GGAATTCC PstI...GCTGCAGC

ADAPTEREK

szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, amelyek végei kompatibilisek

különböző restrikciós endukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel.

Esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatja.

EcoRI – SmaI...5'AATTCCCGGG 3‘

3’GGGCCC 5’

EcoRI

SmaI

Rövid adapterek:

egyik vég ragadós, a másik tompa.

Hosszú adapterek:

két ragadós vég között egy

harmadik restrikiós endonukleáz felismerõhelye

5' GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT 3' 3' GCCCGGGACAATC 5'

pl. BamHI (ApaI) SacI

Primerek

szintetikus oligodeoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontjaiként szolgálnak a templát függő DNS polimerázok számára.

Univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének környékére tervezett primerek.

Specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált speciális szekvenciájú oligonukleotidok.

Polimeráz láncreakció I.

Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb.

Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

Polimeráz láncreakció II.

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ MÓDOZATAI

- belső PCR, specificitás növelése belső primerek használatával egy elsődleges PCR terméken

  - egy specifikus primert használó PCR + primer adapter limitált információ esetén

- LM PCR, ligálás közvetített PCR,

kromoszóma metiláltsági térképezésére - inverz PCR, szegélyező szekvenciák izolálására   - “farkazott PCR” ld. cDNS izolálás

  - RT PCR, reverz transzkripció kapcsolt PCR, ld. cDNS

  - kvantitatív PCR, mRNS mennyiségének becslésére

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI

 klónozás, megfelelő DNS szakaszok kinyerése, esetenként degenerált primerekkel

   DNS szekvenálás, pl. ThermoSequenase    mutagenezis

   szálspecifikus próbák előállítása    diagnosztika

 fertőzések kimutatására

BELSŐ (NESTED) PCR

1. PCR

2. PCR

2 primer párt használunk

 nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése

 költségesebb

EGY SPECIFIKUS PRIMEREN ALAPULÓ PCR

GÉN 'A'

hasítás 'A' enzimmel

GÉN 'A'

ligálás primer/adapterrel 'A'

GÉN 'A'

PCR 'A'

LM PCR, ligálás közvetített PCR,

kromoszóma metiláltsági térképezésére

GÉN 'A'

hasítás 'A' enzimmel

GÉN 'A'

ligálás primer/adapterrel 'A'

GÉN 'A'

PCR 'A'

ha “A” metiláció érzékeny  nincs termék

ha “A” izoskizomerje érzéketlen metilációra  van termék

INVERZ PCR

A géneket környező régiók kiamplifikálkására

Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert  primer pár tervezhető

A A

hasítás 'A' restrikciós enzimmel

A A

önligálás

A

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR (RT-PCR)

mRNS

antiszensz primer

reverz transzkripció reverz transzkriptázzal AMV: avian mieloblastosis virus RT

MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT Tth: Thermus thermophilus, Mn²⁺ jelenlétében cDNS

szensz primer

PCR

250 500 1000750

RT+ RT- gK

bp

Gének szerveződésének

vizsgálatára

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT KVANTITATÍV PCR

Az RNS preparátumnak DNS mentesnek kell lennie

exponenciális rész lineráris szakasz

plató

ciklus szám termék

T

50°C 95°C

72°C

Denaturálás Hibiridizáció DNA szintézis

Real-time PCR

Denaturálás

: SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI

Real-time PCR reakció analízise

Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel

reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát cDNA-sel.

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ

FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: klónozás

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ

FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: DNS szekvenálás

templát DNS

ddATP/dNTP PCR egy primerrel

ddA

ddA ddA

ddA

terminálódott láncok száma

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ

FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis

random: a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb, hibák épülnek be és amplifikálódnak

1-2 hiba 1 kb hosszon

Mn

vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát in vitro evolúció

irányított:

XhoI

XhoI M_r

M_f O1

O2

O1-M_r 1^st PCR-s M_f –O2

BamHI

BamHI CO2 O1

XhoI

BamHI 2^nd PCR O1 – O2

digest with XhoI and BamHI

ligate into XhoI – BamHI digested vector

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.

- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA

minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav,

ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket 

speciálisan tervezett primerek segítségével PCR

a termék megjelenése fertőzésre utal

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II.

MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA

normálisA C gén

mutáns

5' 3'

A 5 C

' 3'

A

5' 3'

PCR

egészséges

nincs termék beteg

A 5 C

' 3'

5 C

' 3'

PCR

egészséges nincs termék beteg

+C R

R +C R M +C R

60^oC 62^oC 64^oC 66^oC

Diagnosztika optimalizálás

XhoI

BamHI

Ligáz láncreakció

5’ A 3’

5’

3’ T

5’ A 3’

3’ T 5’

5’ A 3’

5’

3’ T

5’ A 3’

3’ T 5’

5’ A 3’

5’

3’ T

5’ A 3’

3’ T 5’

5’ A 3’

3’ T 5’

5’ A 3’

3’ T 5’

5’ A 3’

5’

3’ T

5’ A 3’

3’ T 5’

3’ T 5’

3’ T 5’

5’ A 3’

5’ A 3’

denaturáció, hibridizáció

denaturáció, hibridizáció

ligálás,

termostabil ligázzal

ligálás,

termostabil ligázzal

4 primeres, A PCR-t nem tudta

kiszorítani

Ligálás és a PCR kombinálása

GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK

1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből

1. fragment 2. fragment

3. fragment 1+2. fragment

1+2. fragment

1+2+3. fragment

hátrány: drága,

mind a két szálat meg kell szintetizálni

2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel

5’ 5’

5’

5’

3’ 3’

3’

3’

Klenow, dNTP

Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik.

2.a. Hajtű módszer

Klenow, dNTP

5’ 3’

hasított vektor

polimerizáció Klenow, dNTP

ligálás

transzformálás

hibridizálás, enzimatikus feltöltés

5’ 5’

5’

3’3’ 3’

átfedő szintetikus oligonukleotidok

hasított vektor

5’

5’

3’

3’

közvetlen transzformálás

Híd ligálás

2. c. Fragment összeállítás a javító mechanizmus

(gap repair) kihasználásával

A humán szérum albumin HSA szintézise

1864 bp hosszú géne, 60 kDa méretű fehérje.

Magyar projekt, svéd megbízásból SZBK, Biotechnika Rt. 5 kutatója Eleinte még manuális oligo szintézis

A szintézis oka: élesztőben termeltetni  vérpótló szer

A gént négy kb egyenlő részre osztottál, mindegyik kb 450 bp hosszú, Ezeket klasszikus klónozással illesztették össze

5’ 3’

Negyed HSA szintézis stragégiája

pN GGGCC pC G

CTTAA_OH CCCGGG

GCCTAG AATTC

G

pN GGGCCC

CCCGGG G

CTTAA_OH

GGGCCC GGATCN C

CCTAGN HSA1 AATTC

G

pC G

CTTAA_OH CCCGGG

pN GGGCCC

CCCGGG G

CTTAA_OH HSA1

pN GGGCC

HSA2 1. ligálás

2. tompítás 3. ligálás

1. ligálás 2. tompítás 3. ligálás ligálás ApaI-EcoRI

adapter

ApaI-EcoRI adapter

EcoRI-ApaI hasítás

ligálás

GGGCCC

CCCGGG G

CTTAA GGATCN

CCTAGN HSA1 AATTC

G

AATTC G

GC GGATCN

CCTAGN HSA1 GGGCCC

CCCGGG G

CTTAA

HSA2 AATTC

G