• Környezeti változások (folyamatos, hosszabb távú megfigyelések jelentősége)

Monitorozás

bevezető

• Környezeti változások (folyamatos, hosszabb távú megfigyelések jelentősége)

• Szennyezések kimutatása

• Szennyezőanyag tulajdonságai

• Megengedett határértékek – EC (Európai Bizottság),

EPA (Environmental Protection Agency = Amerikai Környezetvédelmi Iroda)

• Molekuláris biológia (bioremediációs eljárások,

monitoring gyors fejlődése)

Fő szennyező források:

•

• mezőgazdaság

• bányászat

• közlekedés

• szakszerűtlen hulladéklerakás

• háztartás

Környezet- és állapot- felmérés szükséges:

• talajszennyezés módja

• kiterjedtsége

• terület szennyezés előtti/utáni haszn.

• geokémiai jellemzők

• szennyeződés kora

Talajszennyezés megnyilvánulása:

•

• toxikus elemek, vegyületek felhalm.

• kémiai összetevők arányának változása

Szennyeződések

Talajszennyezések vizsgálata

A szennyezőanyag fizikai állapota :

• folyadékfilm

• talajrészecskékhez felületi adsz.

• talajpórusokban szilárd v. folyadék

• mikrokapillárisok vizes fázisában Talajszennyezés:

• Pontszerű vagy kiterjedt

• Természetes eredetű és/vagy antropogén

• Szervetlen és/vagy szerves:

- nehézfémek

- kőolaj és kőolajszármazékok - PAH, PCB, BTEX

- felületaktív anyagok

- növényvédő szerek

Szennyezőanyag

nem illékony illékony

oldható Nem oldható

Levegő szennyezés

talajhoz adszorbeálódik

Perzisztens marad mineralizálódi

k

Széntetraklorid CFC-k

Víz szennyező

peszticidek

Talajban mozogva eléri

a talajvizet

kőolajszármazéko k

peszticidek

Nem

bontható lebomlik Akkumulálódik vízben, talajban, táplálkozási láncban

PAH-ok

Kőolajszárm. PCB-k, DDT

A szennyezőanyag sorsa a környezetben függ az

anyag tulajdonságaitól és a környezeti viszonyoktól

monitorozás

• Szükséges a folyamatos és pontos mintavételezés

• Talajok, álló-,folyó-, talajvizek, ill. levegő minőségének meghatározása fizikai, kémiai, biológai vizsgálatokkal

• Gyakran igen sokféle szerves anyag, egyenkénti mennyiségi meghatározása (sőt kimutatása is)

rendkívül körülményes.

A szennyezett talajok, vizek

állapotfelmérésére alkalmazott módszerek

1. Fizikai analizis

– Gravimetria

– pH (pH elektród)

– Kolorimetria (koloriméter, spektrofotometria) szín és zavarosság mérésére pl. vízminőség mérés – Oldott oxigénszint (oxigén elektród), szintén

vízminőség meghatározásra

– Ionok jelenlétének mérése (ionspecifikus

elektród)

2. Kémiai analizis –kromatográfia

• nem illékony, oldékony szennyezők:folyadékkr. HPLC

• illékony komponensek: gázkromatográfia GC (-MS) –spektroszkópia

• Szénhidrogének (olajszennyeződések) : infravörös spektr. (IR)

• Ásványi anyag tartalom - fémek, kén, foszfor:

plazmaemissziós spektrometria (ICP)

• Spektrofotometria UV/VIS

• Atomabszorbciós spektrometria (AAS): fémek kimut.

• Tömegspektrometria (MS) –Kémiai oxigénigény (KOI)

A szennyezett talajok, vizek

állapotfelmérésére alkalmazott módszerek

3. Biológiai analizis

– Sejtszám-, sejttömeg meghatározás – Mikroflóra feltérképezése

– Biológiai oxigénigény (BOI)

– Molekuláris biológiai, biokémiai vizsgálatok - metegenom analizis, proteomika

– Bioindikátorok, biomarkerek, bioszenzorok

A szennyezett talajok, vizek

állapotfelmérésére alkalmazott módszerek

Biológiai úton lebontható, kimutatható szervesanyagok

monitorozása

Biológiai oxigénigény (BOI)

• BOI azt az oxigénigényt méri egy mintában, melyre a

metabolizálható szervesanyag tartalom biológiai oxidálásához szükség van. Csak a biodegradálható anyagokat mérjük

• Jó, de nem tökéletes

• Alternatíva:

– KOI (az összes oxidálható anyagot mérjük), ill. TOC (összes szerves szén tartalom)

– Pontosabb, amikor a KOI/BOI arányát vesszük figyelembe

• Szennyezés monitorozása, koncentráció meghatározás, stb.

kémiai: biológiai:

GC, LC, MS, IR, NMR… bioindikátorok,

biomarkerek

Bioindikátorok

• A környezetben egy reprezentatív, ép szervezet, melyre hat a szennyezés

• Olyan szervezet lehet, melyen keresztül a szennyezés hatása

meghatározható, mennyiségileg megadható, széles körben elterjedt, helyhez kötött (nem vándorol el), egész évben jelen van, könnyen begyűjthető, szenzitív a szennyezésre

• Mi az ami változni fog: ökológiai (pl. populáció sűrűség, a kulcs faj ill. fajdiverzitás változásai), visélkedésbeli (aktivitás vátozás-

tápanyagfelvétel, mobilitás), fiziológiai (pl. nehézfém akkumuláció, CO

termelés, oxigénigény) változások, melyek megfigyelhetők

• Példák: földigiliszta, méh, zuzmó, moha, kagyló, algák

– Főleg a moha, zuzmó megfelelő, mivel nem mobilis, könnyen

begyűjthető, a zuzmó nagyon érzékeny – levegő minőség vizsg. Jó – Méhek a fémszennyezésekre haszn., a begyűjtött pollen, méz, viasz – Kagylók a vizek fém-, és akár szervesanyag szennyezésének detekt.

levegő szennyezésre

talaj szennyezésre

víz szennyezésre

Biomarkerek

• A biológiai rendszerekben történő változásokat

biomarkerek segítségével mennyiségileg mérhetjük, melyek

• fiziológiai, biokémiai, molekuláris biológiai karaktere egy a környezetben jelenlévő szervezetnek, melyre hat a szennyezés

• Előnye a kémiai analizisekkel szemben, hogy hosszabb időn keresztül végezhetjük a méréseket

• 3 csoport: biokémiai-, genetikai-, immunkémiai markerek

1. Biokémiai markerek:

megváltozik azoknak a specifikus enzimeknek a mennyisége, melyek a szennyezés ártalmatlanításában részt vesznek

példák: osztriga - metallotionein fehérje – fémek jelenlétében kagyló – glutation fehérje mennyisége igen sokféle

szennyezésre

tengeri csillag - citokróm P450 pl. PAH-ok jelenlétében

növények - aril hidroxiláz pl. dioxin szennyezésre

Biomarkerek

2. Immunkémiai markerek

az antigén-antitest specifikus reakció kihasználható

xenobiotikumok jelenlétének kimutatására is:

antitesteket elő lehet állítani különböző vegyületek, szerves anyagok pl. PCB-k, dioxinok

… stb. ellen, és ennek

segítségével un. ELISA (enzim kapcsolt immunszorbens teszt) fejleszthető ki a szennyezők detektálására

Biomarkerek

Szennyező ellen fejlesztett antitest antigén

Biotin jelölt antitest Jelölt streptavidin

ELISA

3. Genetikai markerek

A leggyorsabb, és legérzékenyebb módszerek egyike a génexpresszió ellenőrzése

példa: látványos eredményt érhetünk el, ha zöld fluoreszcein fehérjét kódoló génszakaszokat építünk be speicifikus helyekre (mely szakaszok transzkripciója a szennyezés hatására megváltozik) a genomba, így, amikor e baktérium toxikus anyaggal találkozik „fény gyullad” benne

Biomarkerek

Bioszenzorok

• A bioszenzor olyan érzékelő (szenzor v. detektor), amely biológiai rendszert v. annak valamely részét, pl. biokémiai reakciókat,

enzimeket, ellenanyagokat, receptorokat v. mikroorganizmusokat stb. használ fel valamilyen jel felismerésére vagy kimutatására.

Ezek a biológiai anyagok szolgáltatják az érzékelés sajátosságát főként akkor, ha a mérendő jelet másképpen nehéz szelektíven

meghatározni. A bioszenzor rendszerint elektromos jelet hoz létre, amely azután elektromos v. elektronikus berendezésekkel már

feldolgozható.

• Előnyei: gyors, nagyon specifikus válasz, folyamatos érzékelés…

• Hátrányok: biológiai anyag lévén nem sterilizálható, életideje

véges…

Bioszenzorok

MINTA

BIOLÓGIAI ANYAG JELÁTALAKÍTÓ

MENNYISÉGI ANALÍZIS ADATFELDOLGOZÁS Fehérjék

Hormon receptorok Lektinek

DNS

Antitestek Szervecskék Teljes/ép sejtek

Vezetőképesség Optikai

Oxigénelektród Ion szelektív e.

pH elektród Fotodióda …

Bioszenzorok

• Példák: Clark oxigénelektródon alapuló bioszenzor: BOI bioszenzor – oxigénszint változásának mérése, gyors, folyamatos mérési lehetőség

• Minél több a metabolizálható anyag a tápoldatban, annál nagyobb a

metabolikus aktivitása a sejteknek, ezáltal gyorsabb az oxigénredukció, ez mérhető az elektróddal

Ezüst anód

Ezüst klorid elektrolit

platinum katód

gáz áteresztő

teflon membrán Immobilizált

mikroorganizmusok dializis membrán

BOI bioszenzor

Ezüst anód

Ezüst klorid elektrolit

platinum katód

membrán

Hagyományos Clark oxigénelektród

Bioszenzorok

• Peszticidek kimutatására

acetilkolin észteráz + kolin oxidáz: az acetilkolin észteráz az

acetilkolinból kolint képez, a kolin oxidáz ezt hasítja betainra és H2O2-ra. A H2O2 képződése amperometrikusan mérhető

oxigénelektród segítségével. A peszticidek gátolják az acetilkolin észteráz aktivitását, így peszticid jelenlétében kevesebb H2O2

képződik.

• Fenol bioszenzor

a fenol oxidációján alapszik, mely pl. tirozináz v. más oxigenázok segítségével katekollá, ill. kinonná alakul. Az oxigenáz enzimek katalizálta reakióhoz oxigénre van szükség. Ha a rendszerbe

oxigénelektródot kapcsolunk, mérhető az oxigén felhasználás. Az enzim aktivitás toxikus anyagok gátolhatják ezáltal csökken az oxigén felhasználás, ami detektálható (már 50 ppb konc. szint csökkenést mérni tudunk)

fémszennyezés kimutatására is használható

• Általában egyféle szennyezőt kimutató, egy fajt alkalmazó biotesztek, melyek válasza a szennyezőanyag akut toxikus hatását mutatja és csak kevéssé képesek a hosszú távú hatások jelzésére (gyakran rövid ideig tartó vizsgálatok). Az akut hatások jelzőszáma a LC50 (a vizsgált faj 50 %-nak elpusztulását eredményező konc.)

• A tesztorganizmust körültekintően kell kiválasztani, hogy a kapott eredmény alapján következtetéseket vonhassunk le a magasabb trófikus szintek élőlényeire. A különböző tesztorganizmusok érzékenysége egy adott szennyezőanyagra nagy változatosságot mutat. Egy ökoszisztéma érzékenységét a legérzékenyebb fajok érzékenysége határozza meg. Ezért gyakran a szennyezőanyagra legérzékenyebb fajt választjuk tesztelésre.

• Tesztorganizmusok pl: mikroorganizmusok, algák, vízi bolha, halak, madarak

• Tesztek: lumineszkáló szervezetekkel – MICROTOX, BIOTOX, ToxAlert…; Ames teszt, mol. biol. markereken alapuló tesztek

Toxicitás tesztek

metagenom

biodiverzitás

• Bár a mikrobák központi szerepet játszanak a biotikus

folyamatokban, nagyon keveset tudunk valós sokféleségükről

• Fizikai, kémiai, biológiai paraméterek

• Mikrobiális diverzitás, katabolikus gének

• Szaporítható/nem szaporítható mikroorganizmusok

• Környezeti metagenom könyvtár

A Földön előforduló fajok becsült száma, és a szaporítható mikroorganizmusok aránya a

különböző élőhelyeken

• Noha a mikróbák központi szerepet

játszanak a biotikus folyamatokban, nagyon keveset tudunk valós sokféleségükről

• Jelenleg kb 5000 prokarióta fajt ismerünk, de a becsült számuk több, mint 1 000 000!

• A molekuláris technikák fejlődésével új lehetőségek

• A nem szaporítható prokarióták genetikai és biotechnológiai jelentősége hatalmas

Ismert, leírt fajok száma (x1000) becsült fajok száma (x1000) % ismert fajok

A mikroszkópikusan detektálható fajokból a szaporíthatók aránya

Miért fontos, hogy megismerjük a lehető legtöbb mikróba fajt?

• Alapvető szerepet játszottak a bioszféra kialakulásában

• A biogeokémiai ciklusok a mikrobákkal teljesek csak

• Meglepően nagy fiziológiai, biokémiai változatosságot mutatnak

• Képesek extrém körülmények között élni

• Központi szerepet játszanak életünkben, mégis nagyon keveset tudunk róluk

– Molekuláris technikák fejlődésével a mikrobiális ismereteink gyorsan és jeletősen bővülnek

• A különböző élőhelyek mikrobiális sokféleségét akkor tudjuk analizálni, ha a teljes genomot kinyerjük a vizsgálandó

élőhelyről gyűjtött mintából (metagenom)

Talaj metagenom

• A talaj nagyon összetett élőhely

• A mikrobiális heterogenitás a talajban felülmúl minden más környezetet: kimutatták, hogy 1 g talaj több ezer faj akár 10 milliárd egyedét is tartalmazhatja!

• A talaj mikroorg-k ált. a talajmátrixhoz kapcsolódnak

• A sejtek lehetnek egyedül, vagy mikrokolóniát alkotnak, gyakran poliszaharid burokba ágyazva

• A mikrokörnyezet jelentősen befolyásolja a sejtek szaporodását, aktivitását, így két egészen közeli mikrokörnyezet is nagyon

eltérhet egymástól. Ez a heterogenitás eredményezi a mikrobiális élőhelyek nagy változatosságát és a mikrobák sokféleségét

• Jogos tehát a várakozás, hogy a talaj metagenom genetikai sokfélesége még tartogat meglepetéseket, és gazdag forrása lehet ipari jelentőségű enzimek, bioaktív anyagok felfedezésének

DNS kinyerése a környezeti mintából

Komoly problémát jelent, hogy az in situ megfigyelhető mikróba sokféleség, és a szaporító tápon in vitro számolható telepszámok (számlálási anomáliák) között eltérés mutatkozik Torsvik és Goksoyr (1970-es évek végén) - a mikrobiális DNS

közvetlen izolációjának lehetősége környezeti mintákból (elvi felvetés).

Később Pace és mtsai: a metagenomot környezeti mintából extrahálták, részlegesen emésztették, a fragmenteket vektorba ligálták, E. coli-ba klónozták, és az rRNS-ket kódoló géneket vizsgálták

A talaj a legjobb környezet a mikrobiális sokféleség vizsgálatára, de komoly hátránya, hogy a DNS kinyerése során huminsavak is extrahálódnak, melyek gátolják a molekuláris munkákat

A DNS kinyerésére környezeti mintából kétféle extrakciós módszert dolgoztak ki:

 lehet direkt kinyerése a DNS-nek - sok DNS, egyszerű extrakciós eljárás

 Vagy először elválasztjuk a környező anyagoktól a sejteket, és utána extaháljuk a DNS-t - tiszta, nagyon jó integritású DNS

Attól függően, hogy mi a célunk használhatjuk a két módszer egyikét, pl. egy egyedi enzimet kódoló gén kinyeréséhez

alkalmazható az első megoldás, míg multifunkcionális enzimeket kódoló géncsoportok izolálásához célszerű a második módszert használni

DNS kinyerése a környezeti mintából

DNS extrakciós módszerek összehasonlítása

Frakcionálás alapú (közvetett)

• először elválasztjuk a

környezeti minta anyagaitól a sejteket (ezután gyakran

felszaporítjuk), és utána extraháljuk a DNS-t

• Tiszta, nagyon jó integritású DNS nyerhető

• Olyan talajminták esetén

előnyös, ahol nagy mennyiségű olyan anyagot találunk,

amelyek zavarják a DNS izolációt (pl. huminsavak)

• Nagyobb DNS fragmentek, nagy-inszert könyvtár

készítésére alkalmas

Közvetlen lizis

• A sejtek (nem választjuk el a környezeti mintából) lízisét a DNS tisztítása követ

• A sejtek lizisére magas hőmér- sékletet, erős detergenseket, mechanikai törést vagy

fagyasztás-olvasztás módszert alkalmazhatunk

• Jobban reprezentálja a minta valós mikrobiális sokféleségét

• Leggyakrabban ezt használják, mivel sokféle talajra alkalmaz- ható, kevésbé laborigényes, több DNS nyerhető

• Hátránya: kisebb DNS fragmentek keletkeznek

• A genetikai anyag önmagában nem elegendő a mikrobiális környezet megismeréséhez, minket elsősorban az érdekel, hogy

– mit tudnak

– milyen fontos tulajdonságot hordoznak számunkra és a környezet számára

– milyen funkcionális fehérjéik, egyéb molekuláik vannak

– ezen tulajdonságokhoz, fehérjékhez, egyéb sejt által termelt anyagokhoz hogyan juthatunk hozzá

DNS kinyerése a környezeti mintából

A szaporítás alapú (közvetett) és metagenom alapú (közvetlen módszer)

biokatalitikus termék kinyerés összehasonlítása

• A szaporítás alapú (frakcionálás, közvetett) megközelítéssel a jelenlévő mikróbáknak csak egy részét lehet szelektálni és szaporítani tiszta kultúrában. A szaporítható mikroorg-k jellemezhetők, fermentálhatók, és a termék közvetlenül kinyerhető, vagy a gének további tisztítása, klónozása és expressziója szükséges.

• A nem szaporított mikroorganizmusok viszont csak genomjuk extrakciójával hozzáférhetők (közvetlen módszer). Ez esetben az adott környezet összes mikroorganizmusának teljes genomját izoláljuk és klónozzuk egy gazdába (pl.

E. coli) a további vizsgálatokhoz és termék termeltetéshez.

Mikrobiális diverzitás

bioszféra

izoláció

Metagenom izoláció

Transzformáció gazdasejtbe

Transzformáció gazdasejtbe

Vektorba ligálás

DNS izoláció

Vektorba ligálás

Rekombináns enzimek Enzim

karakterizáció Szaporítás

Karakterizáció fermentáció

Általánosan használt technikák a molekuláris mikrobiális ökológiában

Dúsítás és szaporítás

Környezeti minta

Nukleinsavak extrakciója

Specifikus DNS szakaszok felsokszorozása (PCR)

PCR termék vektorba zárása

Vektorok E. coli- ba juttatása

Az egyedi klónok karakteri-

zációja Elektroforeti-

kus nalizis

Tiszta kultúrák

Specifikus DNS szakaszok

azonosítása Próba

specifikus oligonukleotid

okkal

Metagenom analizis

• Az a felismerés, hogy a környezetben élő

mikroorganizmusok többsége nem szaporítható standard módszerekkel, ösztönzőleg hatott a

metagenomika fejlődésére, melyet úgy

definiálhatunk, hogy a mikroorganizmusok szaporítása nélküli genom analizis

• Két típusa:

– Funkció alapú analizis – a kifejeződő tulajdonságokat keressük, vizsgáljuk

– Szekvencia alapú analizis – a könyvtárat egyedi

szekvenciák keresésével hozzák létre

Genomi DNS extrakció környezeti mintából

Szekvencia alapú analízis

Vektorba ligált DNS

transzformáció E. coli sejtekbe

Genomi DNS-ek A DNS-t hordozó

vektor a ligálás után

Hasított vektor

Funkció-alapú analízis

Metagenom analízis

• Amikor egy környezeti mintából kifejezetten egy bizonyos funkciót szeretnénk megtalálni, egy bizonyos enzim

aktivitását kimutatni, nyomon követni több megközelítés lehetséges:

– Bróm jelölt uracil használata, mely a metabolikusan aktív sejtek RNS-eibe épül be

– Izotóp jelölt szubsztrátot alkalmazunk, mely a metabolikusan aktív sejtek szervesanyagaiban jelenik meg

– A környezeti mintából kinyert DNS szakaszokat vektorba építve, pl. E. coli sejteket használva, azok a sejtek tudnak szaporodni, melyek a szubsztrát bontásáért felelős géneket/ tulajdonságokat hordozzák

– Számos egyéb lehetőség is létezik

Metagenom analizis

Specifikus (egy bizonyos tulajdonságért felelős) DNS szakaszok dúsítása környezeti

mintából különböző technikákat alkalmazva