Aktív formában termeltetni a fehérjét, ahogy in vivo előfordul, szekretáltatni, hogy a diszulfid hidak kialakuljanak
ha a fehérje mérgező a gazdasejtre, akkor először inaktív fehérjét állítunk elő, majd ezt aktiváljuk, ehhez kell az in vitro “refolding”
Két fő stratégia:
Az aktív forma esetén “csak” tisztítani kell a fehérjét
Rekombináns fehérjék termeltetési stratégiái
Három fő lépés:
1. Az oldhatatlan “inclusion body”-t szolubilizáljuk,
alacsony vagy magas pH, emelt hőmérséklet, detergensek, magas koncentrációjú szervetlen sók, vagy szerves oldószerek.
A legelterjedtebbek: urea, vagy guanidin-hidroklorid, esetleg redukálószer (pl. DTT) jelenlétében.
2. Refolding
híg fehérje oldattal
- ha nincs diszulfid híd, akkor a fehérje denaturálószer lassú eltávolítása - ha diszulfid hidak vannak, akkor a renaturáció mellett
a diszulfid hidakat is ki kell alakítani, szerkezet stabilizáló hatásuk van.
levegőztetés, tiol-diszulfid párok hozzáadása, pH optimalizálása
3. Az aktív és inaktív forma szétválasztása
pl. affinittás kromatográfia, preparatív SDS-PAGE, RP-HPLC, FPLC stb.
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK AKTÍV FORMÁBA VITELE
trp promoter alapú vektorok
- alaposan vizsgált, jósolható eredmény - erős, 2-30% a rekombináns/összfehérje
- alapállapotban alacsony expresszió, de toxikus fehérjékre ez nem elég, pBR322 vektorban kb 50x-es indukció
- majdnem minden E. coli sejtvonalban használható
- magas kópiaszámú plazmidok nem használhatók, nincs elég trp represszor
Probléma: triptofán elvonás az indukció – egy kissé nehézkes
Kétkomponensű trp alapú expressziós rendszer
Invitrogen p
trpcI
Kromoszómán integrálva
T7 RNS polimeráz alapú vektorok
- T7 promoter nagyon szelektív, a gazdában nincs ilyen promoter általában
- T7 RNS polimeráz 5x gyorsabb, mint az E. coli-é, azaz már a transzkript is domináns
Gazdasejtek:
Standard klónozó vektorok klónozásra BL21 (F-, ompT-, lon-) expresszióra,
lizogén sejtváltozatok: DE3 bakteriofág, immunitási régió, lacI gén,
lacUV5 promoter lacZ eleje + T7 RNS polimeráz génje, integrálva kromoszómába Nagyon toxikus fehérjék esetén
pLysS, pLysE
T7 lizozim: természetes inhibitora a T7 RNS polimeráznak,
E. coli tudja tolerálni, mert nem képes áthatolni a belső membránon pACYC184 vektorba van beépítve, catr, kompatibilis vektor
pLysE nagy mennyiséget,
pLysS kevesebb mennyiséget termel (ellentétes orientáció, tet promoter CE6 bakteriofág
tartalmazza a T7 RNS polimeráz génjét, így az indukció kívülről bejuttatott gén
kromoszóma
lacI lacUV5 lacZ T7 RNS polimeráz
int int
vektor
Prom. RBS
10 vagy T7/lac
termeltetendõ fehérje génje
ORI bla
A pET vektorokon alapuló, indukálható
fehérje termelés elvi sémája
A pET rendszer
pET vektorok
pBR322 származékok,
ampicillin, vagy kanamicin rezisztensek
10 promoter, a T7 fág 10-es génjének (kapszid) erős promótere
T7 promoter van, de nincs transzlációs iniciációs szignál különféle verziók,
stop szignálok bevitele vagy sem, fúziós partner esetleg a C terminálison Visszaszorulóban vannak
1. Transzkripciós vektorok
Nagyon toxikus fehérjék esetén dupla biztosítás:
a T7 promotertől startpont környékére a lac operátor szekvencia klónozása, elegendő lacI biztosítása, a vektorba beépítették ellentétes irányban
T7lac promoteres változatok
Két transzkripciós vektor példa
10 transzkripciós és transzlációs szignálok,
mindegyik típusú egy sorozat különböző leolvasási keretekkel
Egy rövid fúzió az első 10 aminosavval (g10), de NdeI-gyel elkerülhető.
Esetenként 206aa fúzió stabilitás
Transzlációs vektorok
lemezek: ampicillin, IPTG, mindkettő és egyik sem Mik nőnek fel?
1. egyik sem: minden sejt
2. ampicillin: plazmid tartalmú sejtek,
3. IPTG: plazmid mentes sejtek, vagy expressziós mutánsok
4. IPTG, amp.: plazmid marad, de az expressziós készség elveszett
Plazmid stabilitási teszt
p
tacalapú vektorok: pGEX sorozat
GST: mindig N-terminális fúzió elvileg szolubilizál
Nem lehet denaturáltan tisztítani
