A génműködés szabályozásaprokariótákban

1

Általános Genetika

A génműködés szabályozása

prokariótákban

2

Bármely sejtben

adott pillanatban a géneknek csak egy része működik, a többi kikapcsolt állapotban van Konstitutív, housekeeping gének

Regulált

ahhoz, hogy a sejt ezt megvalósíthassa, szüksége van:

1. A gének ki és bekapcsolását végző mechanizmusra

2. Fel kell tudni ismernie azokat a körülményeket, melyek egy gén ki vagy bekapcsolását teszik szükségessé

3

A génműködés szabályozása több szinten megvalósulhat

1. A génátírás (transzkripció) ki-bekapcsolása és hatásfokának szabályozása

2. A mRNS érésének és életidejének szabályozása 3. A fehérjeképződés (transzláció) ki-bekapcsolása

és intenzitása

4. A fehérjeműködés hatékonyságának szabályozása (poszttranszlációs módosítás, végtermék-gátlás)

5. A fehérje életidejének szabályozása által

gén

fehérje

fenotípus

4

Prokarióta

génkifejeződés szabályozás

a transzkripció szintjén

Gazdaságos

Viszonylag lassú

5

1. A transzkripció iniciációjának befolyásolása:

1a) Szabályozó fehérjék kötődése a promóter közelében

• E.coli lac, ara, trp operonjai

1b) RNS-polimeráz szigma alegysége (-faktor) által

• E. coli speciális szigma faktorai stressz stb. esetén

• B. subtilis sporuláció

• B. subtilis SPO1 fág fertőzése

2. A transzkripció terminációjának befolyásolása:

attenuáció – génátírás csendesítése „korai” transzkripció terminációval

• E.coli trp operon

antitermináció – génátírás folytatása terminációs szignál ellenére is

• lambda fág

6

A környezet kétféle módon tud hatni a transzkripcióra

1. A környezeti hatás bekapcsol

inaktív gén(ek)t 2. A környezeti hatás kikapcsol működő gén(ek)t

A lebontó folyamatok génjeire jellemző

szabályozás Az építő folyamatok génjeire jellemző szabályozás

A gének környezet általi ki-és bekapcsolása egyaránt szabályozó fehérjék közvetítésével valósul meg

7

Genetikai kapcsoló: szabályozó fehérje és annak target DNS-szekvenciája Szabályozó fehérjék: represszorok és aktivátorok

Allosztérikus effektor: a szabályozó fehérje konformációját, ezáltal DNS- kötését befolyásoló kismolekula

- korepresszor - koaktivátor - inducer

Operátor régió: a represszor fehérje kötőhelye a DNS-en Pozitív szabályozás: átírás fokozása

– aktiválással

- gátlás megszüntetésével (indukció) Negatív szabályozás: átírás mérséklése

- gátlással (represszió)

- aktiválás felfüggesztésével

OPERON: egy transzkripcionális egységet alkotó (közös promóterről

policisztronos mRNS-re átíródó) gének csoportja, a szabályozó elemekkel együtt REGULON: közös mechanizmussal szabályozott operonok csoportja

Példa:

A lac operon működésének felderítése

(1950-es évek)

9

A lac operon működésének felderítése

Jacques Monod

Andre Lwoff Nobel díj 1965

E. coli laktóz metabolizmusában tanulmányozták az  ún. enzim "adaptáció" jelenségét

az enzim megjelenését a szubsztrát váltja ki

Izotóppal jelzett aminosavak segítségével bizonyították, hogy az enzim a laktóz adást követően újonnan szintetizálódik

Miből "tudja" a sejt, hogy mikor kell termelni a megfelelő enzimeket?

A laktóz hidrolízisét végző enzim, a -galaktozidáz laktózzal és más galaktozidokkal is indukálható

10

 -galaktozidáz

A -galaktozidáz homotetramer enzim

-galaktozidáz enzim mennyiségi meghatározását eleinte specifikus ellenanyaggal (antigalaktozidáz) végezték

A -galaktozidáz enzim nem mindig van jelen az E. coli sejtekben:

csak akkor termelődik, ha laktóz kerül a táptalajba Az inducer (laktóz) eltávolítása leállítja az enzim szintézisét

Tehát a sejtek ki-be tudják kapcsolni a géneket pl. környezeti szignálokra

11

Genetikai térképezés:

> három gén, közvetlenül egymás mellett

lacZ -galaktozidáz

2. lacY galaktozid permeáz

3. lacA galaktozid transzacetiláz

Laktóz adásakor mindhárom gén indukálódik:

> egyszerre szabályozódnak

OPERON – egy génműködési egység (több gén + szabályozó elemeik, melyben a gének együttesen szabályozódnak)

Gének együttes szabályozása

Lac- fenotípus: a mutáns baktérium nem képes a laktózt hasznosítani (kizárólagosan laktózon nőni)

lacZ lacY lacA

12

A béta-galaktozidáz aktivitás kimutatására és az indukció kiváltására mesterséges galaktozid származékokat próbáltak ki

Egyes vegyületek akár 1000x több enzim megjelenését indukálhatják (az alapszinthez képest)

Mesterséges galaktozid származékok

13

A béta-galaktozidáz és a galaktozid transzacetiláz enzimek indukciója különböző galaktozid származékok hatására

pl. az IPTG kiváló indukáló, de nem szubsztrátja az enzimnek (V=0)

> Az indukció független a laktózbontástól (az enzimhez kötődéstől) Más az érzékelő és más a végrehajtó rendszer

Előny az IPTG általi indukcióban, hogy nem fogy az indukció előrehaladtával

14

Kromogén szubsztrátok

egyszerű az aktivitás követése, mert színes termék is keletkezik a reakció során

o-nitrophenyl beta-D-galactopyranosideONPG

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- galactopyranoside

15

Szabályozásban hibás mutánsok

kromogén szubsztátok megjelenése

az alapvető gének (lacZY) megismerése, térképezéseés

> lehetőség nyílt különleges fenotípusú mutációk felismerésére is

-galaktozidáz aktivitást nem mutató illetve túltermelő törzsek könnyen azonosíthatók a színreakciókkal

16

konstitutív mutáns:

- akkor is termel -galaktozidázt, amikor nincs jelen indukáló szer

Ezeket úgy izolálták, hogy az E.coli mutált tenyészetét fenil-β-galaktozid, mint egyedüli szénforrás jelenlétében növesztették. Ez a galaktozid szubsztrátja ugyan a β-

galaktozidáznak, de nem indukálja azt. Ezt csak azok a mutáns sejtek képesek

hasznosítani, amelyek a β-galaktozidázt induktor hiányában is, konstitutívan termelik

Azok a gének, amelyek elrontása a -galaktozidáz konstitutív

termelését eredményezi, ép állapotban gátolják az enzim termelését

Konstitutív és nem indukálható  -galaktozidáz mutánsok

nem indukálható mutáns:

- az indukálószer adása után sem jelenik meg az enzim aktivitása

Izolálásuk: X-gal + IPTG > fehér kolóniák (a sok kék között)

Azok a gének, melyek elrontása megakadályozza a laktóz bontó enzimaktivitás megjelenését, nélkülözhetetlenek az aktivitáshoz, beleértve az enzimet kódoló gént

17

A konstitutív mutánsok térképhelyzet alapján két lókuszt jelöltek ki

lacI lacO

Konstitutív és nem indukálható -galaktozidáz mutánsok térképhelyzete

A nem indukálható mutánsok két fő csoportja a lacZ és lacY területére térképeződött

ezek a laktóz anyagcsere két fő enzimének mutánsai

a lacA gén nem bizonyult nélkülözhetetlennek a laktóz bontáshoz

lacZ lacY lacA

18

A lac operonra nézve részlegesen diploid (parciális diploid) törzsek létrehozása

Az allélek dominanciaviszonyainak megállapítása I.

Genotípus β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálás nélkül

β-galaktozidáz enzimaktivitás

indukálással Fenotípus, következtetés

I⁺Z⁺ (vad) – + ha I⁺, indukálható

I^-Z⁺ + + ha I^-, konstitutív

I⁺Z^- – – ha Z-, nem indukálható

I⁺Z^- / F’ I^-Z⁺ – + indukálható,

I⁺ domináns I^- felett, I⁺ transz módon hat

A lacI gén terméke egy diffúzibilis represszor fehérje

19

A lac operonra nézve részlegesen diploid (parciális diploid) törzsek létrehozása

Az allélek dominanciaviszonyainak megállapítása II.

A lacO egy cisz szabályozó elem (DNS-szakasz) Genotípus β-galaktozidáz

enzimaktivitás indukálás nélkül

β-galaktozidáz enzimaktivitás

indukálással

Fenotípus, következtetés

O⁺Z⁺ (vad) - + ha O⁺, indukálható

O^CZ⁺ + + ha O^C, konstitutív

O^CZ^- és O⁺Z^- - - ha Z-, nem indukálható

O⁺Z^- / F’ O^CZ⁺ + + konstitutív,

O^C cisz domináns módon hat

20

Az Operátor mutációk mindegyike a promóter és a Z lókusz közé eső 21bp-nyi szakaszra térképeződik lacI lacO lacZ lacY lacA

Az operátor mutánsok O szakaszának szekvencia változásai A szekvencia tükörszimmetrikus

A mutánsokban megváltozó bázisok közvetlenül kapcsolódnak a represszorhoz mutáns vad típus

21

LacI represszor

tetramer (2x2 360 aa -helix)

lacI lacO lacZ lacY lacA

22

A lac promoter (P)

A promóter (P) szakaszra eső mutációk (melyek az I és O gének közé

térképeződnek) mindhárom gén transzkripciós kifejeződési szintjét csökkentik A P mutációk az RNS polimeráz kötődését befolyásolják.

23

A lac operon regulációs szakaszának szerkezete

24

A lac operon felépítése és negatív szabályozása

25

A lac operon pozitív szabályozása

CAP (CRP) fehérje + cAMP komplex által valósul meg

A sejtek két cukorforrás közül előbb a glükózt fogyasztják Amíg glükóz hozzáférhető a sejt számára, a lac, ara, mal, gal

operonokról – a laktóz, arabinóz, maltóz, galaktóz indukció ellenére is – csak gyengén folyik az átírás – mert ilyenkor hiányzik a pozitív

szabályozás

CAP = CRP

katabolit cAMP

aktivátor receptor

protein protein

Glükóz hiányában működik

26

Katabolit represszió?

A lac-operon:

• glükóz jelenlétében és laktóz hiányában represszált állapotban van

• glükóz hiányában és laktóz jelenlétében aktív (indukált) állapotban van

• glükóz és laktóz együttes jelenlétében azonban csak gyengén aktiválódik

> a glükóz erős gátló befolyást gyakorol az operon működésére

Kezdetben azt gondolták, hogy a glükóz bontás végtermékei (katabolitjai) gátolják (represszálják) az operon működését, ezért a jelenséget katabolit repressziónak nevezték el

Később bebizonyosodott, hogy a feltételezés hibás, de a helytelen elnevezés ennek ellenére megragadt a szaknyelvben

27

A szabályozás a cAMP szinten keresztül érvényesül

active transcription

28

Az exogén glükóz gátolja:

1. a cAMP képződést

(inaktív = nem foszforilált adenilát cikláz AC)

2. egyéb cukrok felvételét

(pl. laktóz, inaktív permeáz) Kulcs:

a IIA^Glc foszforilált/defoszforilált formáinak aránya

29

A cAMP-CAP komplex egy tükörszimmetrikus DNS szekvenciát ismer fel a promóteren

A komplex kötődése több mint 90^o-al meggörbíti a promóter DNS-ét, ami előfeltétele a polimeráz stabil kötődésének

A cAMP-CAP komplex DNS kötése erősíti a promótert

30

Negatív és pozitív szabályozás egymásra épülése

Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz nincs

nincs átírás

31

Negatív és pozitív szabályozás egymásra épülése

Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz van Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz nincs

gyenge átírás nincs átírás

(„ereszt”)

32

Negatív és pozitív szabályozás egymásra épülése

Glükóz nincs (magas cAMP); laktóz van Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz van

Glükóz van (cAMP alacsony); laktóz nincs

erős átírás

nincs átírás

gyenge átírás

33

A lac operon elemeinek biotechnológiai alkalmazása

Génexpressziós vizsgálatokban: a lacZ-t mint riportergént

Fehérjeexpressziós rendszerekben: a szabályozható lac promótert Génklónozásban: kék-fehér teszt

34

Globális szabályozó mechanizmusok

Jelentős környezeti változások pl. limitált tápanyagforrás

stressz (ozmotikus, hő, oxigén)

Több operon együttes szabályozása – REGULON Általában egy közös szabályozó fehérje által

Pl. az ún. CAP-regulon tagjai:

lac, ara, gal, mal operonok

35

36

Példa:

Az ara operon

kettős pozitív és negatív szabályozása

37

Kettős pozitív és negatív szabályozás az ara operonban

az arabinóz cukor lebontásához szükséges enzimek génjeit és szabályozó elemeiket tartalmazza

3 struktúrgén kódolja az enzimeket:

ara-A ara-B ara-D

Az ara-C gén terméke arabinózzal kapcsolódva képes a promóterre (I)

kötődni, ami lehetővé teszi a transzkripció elindulását.

Erre ráépül még egy másik pozitív kontroll, a cAMP-CAP rendszer, mely azonos a lac- operonban megismerttel.

Kettős aktiválás (pozitív szabályozás):

AraC + arabinóz (induktor) CAP + cAMP

38

Kettős pozitív és negatív szabályozás az ara operonban

Represszió (negatív szabályozás):

Kettős aktiválás (pozitív szabályozás):

AraC + arabinóz CAP + cAMP

Arabinóz hiányában az Ara-C fehérje egy allosztérikus alakváltozás miatt most represszor szerepet játszik.

Egyszerre kapcsolódik az araI

promóterhez és az operátorhoz, ami egy transzkripciót gátló DNS hurkot eredményez.

39

Példa:

A trp operon

finom szabályozás a transzkripció

terminációjával

40

Az E.coli triptofán szintézis útvonalának génjei a reakció sorrendnek

megfelelő sorrendben találhatók a kromoszómán, és közös szabályozás alá esnek

transzkripció

A trp operon

41

nincs transzkripció

triptofán-represszor komplex

Transzkripciós gátlás (represszió) a trp -operon szabályozásában

A trp-operon transzkripciója negatív visszacsatolással szabályozódik:

- magas triptofán szint esetén a trp-represszor komplex az operátorhoz kötődve gátolja a transzkripciót

Meglepő:

- a trp-represszor mutánsok még mindig képesek a génműködést szabályozni a triptofán koncentráció függvényében….

Trp = korepresszor

42

A trp operon finomszerkezete

transzkripció

(transzkripció terminációs jel)

43

A trp mRNS elejének (leader) kétféle másodlagos szerkezete lehet

A színessel jelzett szekvenciák megfelelnek az előző ábrán ugyanígy jelzett szakaszoknak

44

A trp mRNS elejének (leader) kétféle másodlagos szerkezete lehet

A színessel jelzett szekvenciák megfelelnek az előző ábrán ugyanígy jelzett szakaszoknak

trp

kodonok

45

Ha kevés a trp a sejtben, a riboszóma hosszan kötésben tartja az 1-es szakaszt, mert az két triptofánt kódol.

A lassú transzláció miatt a 2-3 kötés stabilizálódik, így 3-4 kötés nem alakulhat ki, ezért folytatódhat a

transzkripció.

Attenuáció (= transzkripció mérséklése) a trp operonban

Ha sok a triptofán a sejtben az 1- es szakasz gyorsan transzlálódik.

Ez esetben a 2-3-as kötés nem alakulhat ki, így stabil 3-4 kötés jön létre, ami a transzkripció idő előtti terminációját okozza, vagyis nem íródnak át az enzimek génjei.

46

A transzkripció iniciációjának szabályozása speciális szigma (σ) faktorok által