Polimeráz láncreakció
Készítette: Feigl Viktória
PCR (polymerase chain reaction)
• A speciális, kiválasztott DNS szekvencia amplifikációja enzimes reakciók ismétlődésével in vitro körülmények között.
• Szelektív módszer, előnye a hagyományos technikákkal szemben, hogy speciális DNS fragment vizsgálatát teszi lehetővé.
• Minden egyes PCR ciklusban a DNS mennyisége a reakcióelegyben megduplázódik, azaz 30 ciklus után 10
9-szerese a kezdeti DNS mennyiségnek.
• A reakció végterméke gélelektroforézissel vizsgálható.
PCR története
Kary B.Mullis (Cetus) fedezte fel 1983-ban
1985-ben jelent meg a cikk 1993-ban kémiai Nobel-díj
Ötlet:
olyan eljárást kellene kifejleszteni, amely a DNS-t mesterségesenmegsokszorozza a DNS-polimeráz enzim segítségével, megismételt duplikációs
ciklusok által.
A DNS polimeráz enzim:
• Megtalálható az élő szervezetekben
• Funkciója a DNS lemásolása a sejt osztódásakor
• A DNS egyik szálához kötődve létrehozza a komplementer szálat.
Az eredeti eljárás:
A kettős szálú DNS két szálra választása
96°C-ra történő hevítéssel
96°C-on a DNS polimeráz lebomlott
enzimet minden ciklusban pótolni kellett
Kevéssé hatékony
Időigényes
Nagy DNS-polimeráz fogyasztás
Folyamatos figyelem
Megoldás: Thermus aquaticus
•Yellowstone Parkban izolálták (1969)
•Thomas Brock és Hudson Brock
fedezte fel
• Magas hőmérsékleten stabilis DNS- polimeráz – nem bomlik le a hevítési
lépésben, nem szükséges minden ciklusban újat hozzáadni
• Eljárás leegyszerűsödése
• Automatizálhatóság
Taq polimeráz
• 1976-ban izolálták a T.
aquatcus-ból
• Hőmésékleti optimuma 80°C
• Hátránya: hibázik, mutációk
• Nem rendelkezik 3’→5’
hibajavító exonukleáz aktivitással
Helyette: Archea
• Pfu, Pwo, de lassabbak
• Megoldás: Taq és Pfu
kombinációja (gyors és
pontos)
Mire van szükség a PCR reakcióhoz?
• DNS-templát vagy cDNS– ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját
• Két primer – amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét
• DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt
• Nukleotidok – amelyekből a DNS- polimeráz felépíti az új DNS-t
• Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz
számára megfelelő kémiai környezetet
A primerek
• Segítségükkel határozható meg az amplifikálandó DNS szakasz
• Komplementerek az amplifikálandó DNS szakasz elejével és végével
• Rövid, mesterséges DNS szálak
• Hosszuk: 17-30 bp
• Nem tartalmaznak komplementer régiót
(egymással nem képeznek primer-dimert)
Primertervezés
• Optimális olvadási hőmérséklet: 60-75 °C
– Olvadási hőmérséklet: Ahol a primer kötőhelyeinek fele foglalt – Nő a primer hosszával
– Túl magas (80°C felett): DNS polimeráz kevéssé aktív – limitált hossz – Legtöbb primer G+C tartalma >50% → magasabb olvadáspont
– Két primer egyező olvadási T → nem specifikus termékek elkerülése és mindkét primer felől azonos amplifikáció
– Rövid primerek: több helyre kapcsolódhatnának →nem specifikus kópiák
• Optimális hossz: 20-40 nukleotid
• Specifikus gén vagy egy adott mikroorganizmus faj
detektálásához – A keresett DNS-re specifikus primer, amely kizárólag a target szekvenciához kapcsolódik
• Mikroorganizmus csoport detektálásához – DNS konzervált régiójára tervezni
Degenerált primerek
• Hasonló, de nem azonos primerek keverékei
• Ha ugyanazt a gént különböző organizmusokból kell amplifikálni (hasonló, de nem azonos
gének)
• Ha a tervezésnél a fehérjeszekvenciát veszik figyelembe (egy aminosav több kódon)
• Csökkentik a PCR amplifikálás specifitását
• Problémát részben megoldja a Touchdown PCR
PCR eljárás
1. Denaturáció (94-96°C, 1-2 perc)
– A két DNS szálat összekötő H-hidak felbomlanak (1.
ciklus előtt hosszabb denaturálás a teljes szeparációhoz)
2. Primertapadás / annealing (55-60°C, 1-2 perc)
– A primerek hozzákapcsolódnak a DNS szálakhoz
– Hőm. ált. 5°C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt
3. Lánchosszabbítás (72°C, 1-2 perc)
– A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat
– T és t függ a DNS-polimeráztól, t az amplifikálandó szakasz hosszától (ált. 1000 bp/perc)
– Utolsó ciklus után hosszabb lánchosszabbítás
A PCR-ciklus
sematikus ábrája.
(1) Denaturálás (2) Primertapadás
(3) Meghosszabbítás (P=polimeráz).
(4) Az első ciklus véget ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.
Detektálás - Gélelektroforézis
A PCR-termék összehasonlítva a DNS- létrával agargélen. A DNS-létra (1. sáv), a PCR-termék alacsony koncentrációban (2.
Nested PCR
Nem specifikus primerkötések, azaz nem kívánt termékek (szennyeződés)
kiküszöbölésére.
Két sorozat primer két egymást követő PCR reakcióban. A második primerpár (nested primer) az első reakció
termékén belül köt („fészkel”).
Elv: Ha az első primer rossz helyre köt, nagyon kicsi az esélye, hogy a másodiknak is legyen nem kívánt kötőhelye, azaz ezután is legyen nem kívánt termék.
Touchdown PCR
• A specifitás növelésére
• Elv: a primertapadás hőmérséklete meghatározza annak specifitását – alacsonyabb hőmérsékleten a primer kevésbé specifikusan köt
• A kezdeti hőmérséklet a primerek olvadási jóval hőmérséklete (Tm) fölött van
• A hőmérsékletet ciklusonként 1-2 °C-kal csökkentik; a primer a lehető legmagasabb, még elviselhető hőmérsékleten fog tapadni, itt a legnagyobb a specifitás
• Később ezek a fragmensek amplifikálódnak tovább, elnyomva a nem specifikus termékeket
• A hőmérséklet fokozatosan csökken a primer Tm-hez (touchdown hőmérséklet, ideális), utána itt folytatódik a primertapadás további 10 vagy több cikluson át
Inverz PCR
Ha a target szakaszon belül ismert egy szekvencia – a két szélén nem
Emésztés (kis szakaszokra)→
önligálás (cirkuláris forma)
→ hasítás restrikckiós enzimmel az ismert
szekvencián belül → ismert két szélső szekvencia →
PCR
Szélen elhelyezkedő transzpozonok és genomikus inzerciók identifikálására
Reverz Transzkripció PCR (RT-PCR)
RNS amplifikációjára
Reverz transzkripció „primerje”: oligo dT, ami az RNS 3’ végének poliA
szekvenciájához köt (helyette lehet random hexamer vagy specifikus primerek)
Alkalmazások:
•Kis mennyiségben jelen lévő RNS-ek detektálása
•cDNS könyvtárak létrehozása
Real-Time PCR
Kvantitatív módszer!
Minden PCR ciklus után megadja a DNS mennyiségét „real-time”
* Fluoreszcens festék – a kettős szálú DNS-hez köt
* DNS oligonukleotid próba – a kiegészítő szálhoz kötve fluoreszkál
Gyakran a Reverz Transzkripció PCR-ral együtt használják kis mennyiségű RNS (mRNS)
mennyiségének meghatározására – a gén expresszió szintjének mérése
Hagyományos módszer: Northern blotting,
hátránya, hogy csak nagy mennyiségű RNS esetén
működik
Fluoreszcens festék
SYBR Green
- Kétszálú DNS-hez köt (egyszálúhoz és primerhez nem) miután a DNS-polimeráz megszintetizálta a 2. szálat, fluoreszkál → detektorral mérhető
- Standard hígítási sorhoz hasonlítva mérhető a mennyiség
- Relatív mennyiséget ad meg
- Hátrány: Nem sepcifikus PCR
termékekhez is köt, Előny: Relatíve olcsó
– Cianid festék
– Kék fénnyel indukálható (λmax = 488 nm) zöld fényt bocsát ki (λmax = 522 nm)
– Mutagén etídium-bromid helyett használható – Egyéb festékek:
SYBR Gold, YO (Oxazole Yellow),
Fluoreszcens oligonukleotid próba – FRET módszer Fluorescence (or Förster) Resonance Energy Transfer
Két fluorofór:
• Zöld (rövid λ): reporter dye
(„jelző”), 5’ végen, (gyakran GFP)
• Piros (hosszú λ) : quenching dye („elnyomó”), 3’ végen
• Az piros fluorofór elnyeli a zöld által kibocsátott fényt FRET által
• A próba hozzáköt a DNS-hez, majd a polimeráz működése közben
eltávolítja. Így a zöld fluorofór
eltávolodik a pirostól és a kibocsátott fény mérhető.
• Előnye: specifikus!
• Egyszerre több szekvencia is
detektálható többféle színű festék
Molecular Beacon TaqMan
Különbség: A molecular beacon intakt marad, minden ciklusban újra tud kötni.
Denaturáció során a hajtű szerkezet felbomlik, köt a DNS-hez és fényt emittál, mivel a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól. (Ami nem köt az visszanyeri a hajtű
Mennyiségi meghatározás
Minél nagyobb a kezdeti target DNS mennyisége, annál hamarabb észlelhető
szignifikáns növekedés a fénykibocsátásban.
A fix küszöbértéket egy adott ciklusban éri el a fluoreszcencia (CT = cycle treshold), amit logaritmikus diagramon ábrázolva standard hígítási sorhoz viszonyítva meghatározható a kezdeti DNS mennyisége (relatív – minták egymáshoz hasonlítása)
Felhasználás:
A gén transzkripció érzékeny mennyiségi meghatározására.
Diagnosztika: fertőző betegségek, rák, genetikai rendellenességekben szerepet játszó gének gyors detektálására.
Génexpresszió változásának nyomon követése:
Szövet vagy sejtkultúrák reakciója
gyógyszerekre, környezeti körülmények
