Biotechnológia Biotechnológia –– bevezetésbevezetés

Biotechnológia Biotechnológia – –

bevezetés bevezetés

Biokémia Biokémia Mikrobiológia Mikrobiológia

Mérnöki tudományok Mérnöki tudományok

 Mikroorganizmusok, állati és növényi sejtek/ szövetek vagy ezek részeinek (pl. enzimek) felhasználása céljából

A biotechnológia alkalmazási területei

Gyógyszeripar (egészségügy, antibiotikumok, vírus ellenes szerek enzimek, aminosavak, vitaminok, peptidek, szteroidok)

Élelmiszeripar (keményítők, cukrok, illat és színanyagok, sör- és alkoholos italok előállítása)

Mezőgazdaság (állat- és növényegészségügy, takarmány-kiegészítők, vitaminok, adalékanyagok)

Embriómanipuláció (génsebészet) Biometallurgia

Biológiai ásványfelhasználás (meddő kőzetek hasznosítása, amelyek hagyományos módon nem dolgozhatók fel)

Fermentáció: mikroorganizmusok optimális körülmények melletti tenyésztése és metabolitok (hasznos metabolitok) előállítása

Alkalmazása pl.: szövettenyésztés, rögzített sejtek, enzimek alkalmazása gyógyszerek stb. előállítására

Vegyipar: etanol, szerves savak, biopolimerek stb. előállítása

A fermentációs (biotechnológiai) eljárások céljai/lehetőségei

Sejttömeg termelés — pékélesztő, SCP

Sejtkomponensek előállítása — intracelluláris enzimek, poliszacharidok, nukleinsavak…

Metabolit termelés — primer: etanol, tejsav…

szekunder: antibiotikumok

Egyszerű szubsztrát konverzió — glükózfruktóz

penicillin 6-NH₂-penicillánsav

Multi-szubsztrát konverzió — biológiai szennyvíztisztítás

A termékképző folyamat fajtái

Fermentációs folyamat (bioszintézis)

Szaporodó sejtek

 Tápanyagok  Termékek

Biotranszformáció / Biokonverzió

Sejt, sejtalkotórész

A Anyag B Anyag

Enzim

A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai (klasszikus)

 Alkoholok (etanol, butanol, glicerin, alkoholos oldatok – sör …)

 Szerves savak (Ecetsav, citromsav, glukonsav, tejsav…)

 Aminosavak (Glu, Lys, Arg, Try, …)

 Enzimek (Amilázok, katalázok, …)

 Vitaminok (B_x, b-karotin)

 Antibiotikumok (penicillinek)

 Szteroidok (fogamzásgátló intermedierek)

 Poliszacharidok

A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai (modern)

 Monoklonális ellenanyagok

 Immunreagensek

 Inzulin

 Humán növekedési hormon

 Marha somatrotropin

 Plazminogén aktivátor

 Interferonok

 Kalcitonin

 Hepatitis B-vakcina

Az ipari jelentőségű

mikroorganizmusok típusai

Baktériumok: méret 0.5-5 µm; gömb, pálca vagy spirális osztódással szaporodnak, egyesek spóraképzők

Sugárgombák: (aktinomiceták): fonalas szerkezet (micélium), hosszirányú növekedés, spóraképzők (szaporító képlet)

Élesztők: ovális alakú, 5-20 µm, szaporodás főleg

sarjadzással, a leánysejtek együtt maradnak 1-10 sejtig.

Penészek: 4-20 µm fonalas szerkezet (hifa), szaporodásuknál az ivaros és vegetatív szakaszok váltakoznak, jellegzetes spóratartókat fejlesztenek.

Az ipari jelentőségű

mikroorganizmusok típusai

Saccharomyces Schizosaccharomyces

ellipsoideus octosporus Aspergillus niger Penicillium glaucum

A baktériumok gyakori morfológiai típusai

Gombák

A mikroorganizmusok fejlődését, növekedését befolyásoló tényezők

 Tápanyagok

Víz

Makrotápelemek Mikrotápelemek

Növekedési faktorok, vitaminok

 Oxigén

Aerob, anaerob…

 Hőmérséklet

Pszichrofil, mezofil és termofil

 pH

Táplálkozási típusok

szénforrás és energiaforrás alapján

 Fototróf (fényenergia hasznosítás)

 Fotolitotróf (C-forrás CO₂)

 Fotoorganotróf (C-forrás szerves vegyület)

 Kemotróf (redoxi reakciók energiájának hasznosítása)

 Kemolitotróf

 Kemoorganotróf

Egy termelő fermentációs

folyamat megvalósításának lépései

ooooo ooooo

   

1. Oltóanyag 1. Oltóanyag Termelő törzs Termelő törzs

4.B. Levegőztetés 4.B. Levegőztetés Anyagátadás Anyagátadás

3.3.ReaktorReaktor 2. Tápanyagok2. Tápanyagok 2.A. Sterilezés 2.A. Sterilezés

SiSi

4.A. Keverés (anyagátadás) 4.A. Keverés (anyagátadás)

5. Mérés (adatok)

5. Mérés (adatok) 6. Matematikai 6. Matematikai modell

modell

7. Termék feldolgozási műveletek 7. Termék feldolgozási műveletek Szabályozás, vezérlés

Szabályozás, vezérlés

Ipari mikrobiológiai műveletek kivitelezése

1. Oltótenyészet készítése (termelő törzs)

2. Tápanyagok- tápoldat készítése (sterilezés) 3. Bioreaktor

4. Fermentációs műveletek (levegőztetés, keverés…) 5. Adatgyűjtés

6. Matematikai modellezés

7. Termékek további feldolgozása (izolálási, tisztítási műveletek)

Törzsszelekció, törzsjavítás, törzsfenntartás

1. Törzsszelekció:

2. Törzsjavítás, törzsfejlesztés

Nagyobb termelőképességű mutánsok (pl.

Enzimfehérjében változás bioszintetikus útban blokk)

3. Törzsfenntartás

Cél: maximális termelőképesség megőrzése

folyamatos átoltás termelőképesség csökken tartósított tenyészetek

Fermentációs folyamat – oltótenyészet útja

Kémcső tenyészet (10 ml)

Rázott lombikos tenyészet

(100 ml) Labor fermentoros

tenyészet

(10 l) Inokulum fermentoros

tenyészet (2-3 m ³)

Üzemi fermentor

(50-150 m ³)

Sűrített levegő  

Üzemi

fermentorok

szerelvényei

Fermentációs tápoldatok

C-forrás + N-forrás + O

+ ásványi sók + speciális tápanyagok (pl. vitamin)

Új sejttömeg (ΔX) + termékek + CO

+ H

O

Tápanyag igény

Tápoldatok (természetes alapú, félszintetikus,

szintetikus)

Fermentációs tápoldatok

Fermentációs tápoldat mikroorganizmusok

testanyagainak felépítésében, és a termékek szintézisében részt vevő elemeket tartalmaznia kell

Mikróba táplálkozási és környezeti igényei

optimalizálás Gazdasági szempontok

Természetes alapú: élesztőkivonat, húskivonat, pepton…

Fészintetikus: kukoricakeményítő, szójaliszt, zselatin…

Szintetikus (C-forrás, N-forrás….)

Sterilezés

• Tápoldatok sterilezése

+ Besugárzással (UV, X-ray, g) bár ezeknek ipari jelentősége csekély + Kémiai eljárások

+ Csírák mechanikus eltávolítása

+ Gőzsterilezés: Vegetatív sejtek és spórák pusztítása

• Szakaszos sterilezés

+ Minden berendezést külön ki kell sterilezni: rendkívüli idő- és energiaigény + Sterilezőszer: 1,5-3bar nyomású gőz

• Folyamatos sterilezés

+ A szakaszos sterilezés hátrányit kiküszöbölik + Sterilezőszer: szintén gőzbefúvatás

+ Hátránya lehet: A nagy hőmérséklet különbség miatt sók csapódhatnak ki.

• A fermentációs levegőáram sterilezése

A mikroorganizmusokra a legnagyobb veszélyt a levegővel bekerülő szennyeződések jelentik, ezért ennek sterilitására különösen kell figyelni. + Szűrés, besugárzás, hőkezelés + Régebben mélyszűrők (üveggyapot)

+ Ma: üvegszálbetétes szűrőpatronok

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája

A B

C D E

10 ⁴ F 10 ⁸ x

t

A tenyészet fejlődésének szakaszai:

A. Lappangási (lag) szakasz

B. Gyorsuló növekedés szakasza C. Exponenciális növekedés

szakasza, korlátlan,

kiegyensúlyozott növekedés.

D. Lassuló, limitált vagy korlátozott szaporodás E. Stacionárius, stagnáló

szakasz

F. Hanyatló szakasz

tt_{g g} – generációs idő (két egymást követő osztódás között eltelt idő)– generációs idő (két egymást követő osztódás között eltelt idő) tt – minimális és állandó generációs idő – minimális és állandó generációs idő

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája

x₀ -a kiindulási mikrobakoncentráció n - a generációk száma

t_g - a generációs idő

(két sejtosztódás között statisztikai átlagban eltelt idő)

A generációs idő függ a mikróba fajtól, a tenyésztési

körülményektől (tápanyag, hőmérséklet, pH, stb.), sőt még egy adott tenyésztés folyamán is változik.

x₀   2x₀   4x₀   ...   2ⁿ x₀

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája

xx₀2ⁿ átrendezve: n x x

loglog log

0

2

nt t_g

 azaz logx xloglog t t_g

 ⁰2

logxlog xtt

g 0

2 vagymásformában: lnxln xtt

g 0

2 A generációk száma kifejezhető

A generációs idő kifejezhető

1 x

dx

dt azegységnyimikrobatömegrevonatkoztatottszaporodás

A növekedési sebesség arányos a jelenlévő mikróba-mennyiséggel A növekedési sebesség arányos a jelenlévő mikróba-mennyiséggel

µ - µ - Az exponenciális szakasz jellemző állandója Az exponenciális szakasz jellemző állandója

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája

 _x

 _max

S

 

max 

S K_S S KKss

µµ_maxmax 2 2

A A µµ_xx és a szubsztrátkoncentráció kapcsolata (Monod modell)és a szubsztrátkoncentráció kapcsolata (Monod modell) S – nélkülözhetetlen tápanyagkomponens

S – nélkülözhetetlen tápanyagkomponens Ha S kicsi :

Ha S kicsi : µµ arányos S-el arányos S-el Ha S nagy telítettségi értékHa S nagy telítettségi érték

Ks- telítési állandó, megegyezik azzal a S-koncentrációval, ahol Ks- telítési állandó, megegyezik azzal a S-koncentrációval, ahol

µµ = = µµ_maxmax 22

Ks – baktériumok Ks – baktériumok

glükóz 3-7 mg/l glükóz 3-7 mg/l

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája

_S x

dS

 1 dt

_P

x dP

 1 dt

Y x

dx dt x

dS dt

dx dS

x S

   



1 1

µµ_xx - - Specifikus növekedési sebességSpecifikus növekedési sebesség

µµ_ss - Specifikus szubsztrát-felhasználási sebesség - Specifikus szubsztrát-felhasználási sebesség µµ_pp - Specifikus termékképződési sebesség - Specifikus termékképződési sebesség

Y – hozamkonstans Y – hozamkonstans

A növekedés és a tápanyag- A növekedés és a tápanyag-

felhasználás között egyszerű felhasználás között egyszerű

összefüggés összefüggés

Termékképződési kinetika

..\Képek\img002.jpg ..\Képek\img002.jpg

Termékképződési kinetika

µµ_pp - Specifikus termékképződési sebesség - Specifikus termékképződési sebesség _P

x

dP

 1 dt

Különböző fermentációs típusok a

Különböző fermentációs típusok a µµ_xx, , µµ_ss, , µµ_pp alapján alapján I. típus

I. típus II. típusII. típus

µµ_xx µµ_ss µµ_pp

I.I. Termékképződés párhuzamos a növekedéssel (alkoholos erjesztés, Termékképződés párhuzamos a növekedéssel (alkoholos erjesztés, szorbózfermentáció…primer anyagcsere termék)

szorbózfermentáció…primer anyagcsere termék)

II.II. Termékképződés későn kezdődik – növekedéshez nem kapcsolódó Termékképződés későn kezdődik – növekedéshez nem kapcsolódó A legtöbb antibiotikum fermentáció – szekunder anyagcseretermék A legtöbb antibiotikum fermentáció – szekunder anyagcseretermék

Fermentáció típusok

Batch-fermentáció (szakaszos fermentáció): ez a fermentáció típus képezi az összes ma alkalmazott technika alapját, így a mennyiségi összefüggéseket ez alapján mutatjuk be

A paraméterek többségére nézve zárt rendszer

Feed-batch (rátáplálásos) fermentáció: a paraméterekre nézve „félig- nyitott” rendszer

Kezdetben nem az összes mikroorganizmust tápláljuk be, hanem szakaszosan rátáplálunk

A paraméterek követik a tápanyagtartalmat Folyamatos fermentáció:

Folyamatos tápoldat bevezetés, és termékelvétel A paraméterekre nézve nyílt rendszer

Megvalósítása: kemosztátban, turbidosztátban, Plug-flow reaktorban

Folyamatos fermentáció előnyei

• Produktivitása 510- szer nagyobb, mint a szakaszos tenyésztésé

• Automatizálási lehetőség nagy, az üzem egésze folytonossá tehető

• Egyenletes terméket biztosít

Folyamatos fermentációs rendszerek

• Homogén rendszer

– A sejt és a szubsztrát-koncentráció teljesen egyöntetű

– Állandósult állapotú folytonos működés esetén az összes mikróba azonos környezeti feltételek között növekszik- azonos fiziológiai állapotban vannak a rendszeren belül

• Heterogén rendszer

– A sejtek és a szubsztrátok koncentráció-gradienst mutatnak – A mikróbák különböző fiziológiai állapotban vannak

• Zárt rendszerek

– A mikroorganizmusok mindig a rendszeren belül maradnak (szemipermeábilis hártya, állandó visszavezetés…)

• Nyílt rendszerek

– A sejtek a kiömlő folyadékkal folytonosan távoznak

Nyílt folytonos

rendszerek osztályozása

• Homogén rendszerekHomogén rendszerek

•EgyfokozatúEgyfokozatú

•Kevert tankKevert tank

•Kevert tank Kevert tank visszatáplálással visszatáplálással

•TöbbfokozatúTöbbfokozatú

•Egyszerű láncEgyszerű lánc

• Többszöri szubsztrát Többszöri szubsztrát adagolás

adagolás

•Heterogén rendszerekHeterogén rendszerek

•EgyfázisúEgyfázisú

• csőreaktor csőreaktor

visszatáplálással visszatáplálással

•Többfázisú toronyTöbbfázisú torony

• folyadék-folyadékfolyadék-folyadék

Zárt folytonos

rendszerek osztályozása

HomogénHomogén

kevert tank visszatáplálássalkevert tank visszatáplálással

HeterogénHeterogén

 EgyfázisúEgyfázisú

 Csőreaktor Csőreaktor

visszatáplálással visszatáplálással

 Osztott tank Osztott tank

visszatáplálással visszatáplálással

 KétfázisúKétfázisú

 HártyatenyészetHártyatenyészet

 Töltött toronyTöltött torony