Biotechnológia
Biotechnológia – – bevezetés bevezetés
• Mikroorganizmusok, állati és növényi sejtek/ szövetek vagy ezek részeinek (pl. enzimek) felhasználása céljából
Biokémia
Biokémia Mikrobiológia Mikrobiológia Mérnöki tudományok
Mérnöki tudományok
Alkalmazás
A biotechnológia alkalmazási területei
Gyógyszeripar (egészségügy, antibiotikumok, vírus ellenes szerek enzimek, aminosavak, vitaminok, peptidek, szteroidok)
Élelmiszeripar (keményítők, cukrok, illat és színanyagok, sör- és alkoholos italok előállítása)
Mezőgazdaság (állat- és növényegészségügy, takarmány-kiegészítők, vitaminok, adalékanyagok)
Embriómanipuláció (génsebészet) Biometallurgia
Biológiai ásványfelhasználás (meddő kőzetek hasznosítása, amelyek hagyományos módon nem dolgozhatók fel)
Fermentáció: mikroorganizmusok optimális körülmények melletti tenyésztése és metabolitok (hasznos metabolitok) előállítása
Alkalmazása pl.: szövettenyésztés, rögzített sejtek, enzimek
A fermentációs (biotechnológiai) eljárások céljai/lehetőségei
Sejttömeg termelés —
pékélesztő, SCPSejtkomponensek előállítása —
intracelluláris enzimek, poliszacharidok, nukleinsavak…Metabolit termelés —
primer: etanol, tejsav…szekunder: antibiotikumok
Egyszerű szubsztrát konverzió —
glükózfruktózpenicillin 6-NH2-penicillánsav
Multi-szubsztrát konverzió —
biológiai szennyvíztisztításA termékképző folyamat fajtái
Fermentációs folyamat (bioszintézis)
Szaporodó sejtek
Tápanyagok Termékek
Biotranszformáció / Biokonverzió
Sejt, sejtalkotórész
A Anyag B Anyag
A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai (klasszikus)
Alkoholok (etanol, butanol, glicerin, alkoholos oldatok – sör…)
Szerves savak (Ecetsav, citromsav, glukonsav, tejsav…)
Aminosavak (Glu, Lys, Arg, Try, …)
Enzimek (Amilázok, katalázok, …)
Vitaminok (Bx, b-karotin)
Antibiotikumok (penicillinek)
Szteroidok (fogamzásgátló intermedierek)
Poliszacharidok
A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai (modern)
Monoklonális ellenanyagok
Immunreagensek
Inzulin
Humán növekedési hormon
Marha somatrotropin
Plazminogén aktivátor
Interferonok
Kalcitonin
Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok típusai
Baktériumok: méret 0.5-5 µm; gömb, pálca vagy spirális osztódással szaporodnak, egyesek spóraképzők
Sugárgombák: (aktinomiceták): fonalas szerkezet (micélium), hosszirányú növekedés, spóraképzők (szaporító képlet)
Élesztők: ovális alakú, 5-20 µm, szaporodás főleg
sarjadzással, a leánysejtek együtt maradnak 1-10 sejtig.
Penészek: 4-20 µm fonalas szerkezet (hifa), szaporodásuknál
az ivaros és vegetatív szakaszok váltakoznak, jellegzetes
spóratartókat fejlesztenek.
Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok típusai
A baktériumok gyakori morfológiai típusai
Gombák
A mikroorganizmusok fejlődését, növekedését befolyásoló tényezők
Tápanyagok
Víz (gombák 12%, baktériumok 20%) Makrotápelemek
Mikrotápelemek
Növekedési faktorok, vitaminok
Oxigén
Aerob, anaerob…
Hőmérséklet
Pszichrofil, mezofil és termofil
pH
Táplálkozási típusok
szénforrás és energiaforrás alapján
Fototróf (fényenergia hasznosítás)
Fotolitotróf (C-forrás CO
2)
Fotoorganotróf (C-forrás szerves vegyület)
Kemotróf (redoxi reakciók energiájának hasznosítása)
Kemolitotróf
Kemoorganotróf
Egy termelő fermentációs folyamat megvalósításának lépései
ooooo ooooo
1. Oltóanyag 1. Oltóanyag Termelő törzs Termelő törzs
4.B. Levegőztetés 4.B. Levegőztetés Anyagátadás Anyagátadás
3.3.ReaktorReaktor 2. Tápanyagok2. Tápanyagok 2.A. Sterilezés 2.A. Sterilezés
SiSi
4.A. Keverés (anyagátadás) 4.A. Keverés (anyagátadás)
5. Mérés (adatok)
5. Mérés (adatok) 6. Matematikai 6. Matematikai modell
modell
7. Termék feldolgozási műveletek 7. Termék feldolgozási műveletek Szabályozás, vezérlés
Szabályozás, vezérlés
UP STREAM MŰVELETEK
A tenyésztéshez / átalakításhoz közvetlenül kapcsolódó műveletek:
• Tápoldat (reakcióelegy) készítés
• Sterilezés
• Tenyésztés optimális körülményeinek biztosítása
• Anyagátadási és hőátadási műveletek stb.
A FERMENTLÉ FELDOLGOZÁSA (DOWN- STREAM PROCESSING)
1. Szilárd-folyadék elválasztás ( a fermentlé folyadékfázisától különítik el a sejttömeget, és/vagy a táptalaj szilárd szemcséit, esetleg a
kikristályosodott terméket.)
Jellemző műveletek: szűrés, centrifugálás, membránszűrés
(Sejtfeltárás) Csak akkor szükséges, ha a kinyerni kívánt anyag a sejteken belül található (intracelluláris).
2. Izolálás (a legnagyobb mennyiségű szennyezéseket, elsősorban a vizet távolítják el, általában fázisváltással.)
Jellemző műveletek: extrakció, adszorpció
3. Tisztítás (a termék és a szennyező anyagok elválasztása)
Jellemző műveletek: kicsapás, membránszűrés, kromatográfia 4. Végtisztítás (a terméket a forgalomba hozás - a gyógyszerek
esetében igen szigorú - előírásainak megfelelő tisztaságig tisztítják.)
Ipari mikrobiológiai műveletek kivitelezése
1. Oltótenyészet készítése (termelő törzs)
2. Tápanyagok- tápoldat készítése (sterilezés) 3. Bioreaktor
4. Fermentációs műveletek (levegőztetés, keverés…) 5. Adatgyűjtés
6. Matematikai modellezés
7. Termékek további feldolgozása (izolálási, tisztítási
műveletek)
Törzsszelekció, törzsjavítás, törzsfenntartás 1. Törzsszelekció: mikroorganizmusok izolálása
(törzsgyűjteményből, szennyvízből, talajból…) Mérsékelt termelőképességű törzsek
2. Törzsjavítás, törzsfejlesztés
Nagyobb termelőképességű mutánsok (pl.
Enzimfehérjében változás bioszintetikus útban blokk)
3. Törzsfenntartás
Cél: maximális termelőképesség megőrzése
folyamatos átoltás termelőképesség csökken
tartósított tenyészetek
Fermentációs folyamat – oltótenyészet útja
Kémcső tenyészet (10 ml)
Rázott lombikos tenyészet
(100 ml) Labor fermentoros
tenyészet
(10 l) Inokulum fermentoros
tenyészet (2-3 m 3)
Üzemi fermentor
(50-150 m 3)
Sűrített levegő
Üzemi
fermentorok
szerelvényei
Fermentorok
Mini enzimfermentor
Enzimfermentor szabályozó egységekkel
Pilot méretű fermentáció (orvosi kutatás)
Fermentációs tápoldatok
C-forrás + N-forrás + O
2+ ásványi sók + speciális tápanyagok (pl. vitamin)
Új sejttömeg (ΔX) + termékek + CO
2+ H
2O
Tápanyag igény
Tápoldatok (természetes alapú, félszintetikus,
szintetikus)
MIKROORGANIZMUSOK TÁPANYAG IGÉNYE
Néhány mikróbaösszetétel
TERMELŐKÉPESSÉG KÖRNYEZET GENOM
Fermentációs tápoldatok
Fermentációs tápoldat mikroorganizmusok testanyagainak felépítésében, és a termékek szintézisében részt vevő elemeket tartalmaznia kell
Mikróba táplálkozási és környezeti igényei optimalizálás
Gazdasági szempontok
Természetes alapú: élesztőkivonat, húskivonat, pepton…
Félszintetikus: pl. kukoricakeményítő, szójaliszt +sók…
Szintetikus (C-forrás, N-forrás….)
Sterilezés
• Tápoldatok sterilezése
+ Besugárzással (UV, X-ray, g) bár ezeknek ipari jelentősége csekély + Kémiai eljárások
+ Csírák mechanikus eltávolítása
+ Gőzsterilezés: Vegetatív sejtek és spórák pusztítása
• Szakaszos sterilezés
+ Minden berendezést külön ki kell sterilezni: rendkívüli idő- és energiaigény + Sterilezőszer: 1,5-3bar nyomású gőz
• Folyamatos sterilezés
+ A szakaszos sterilezés hátrányait kiküszöbölik + Sterilezőszer: szintén gőzbefúvatás
+ Hátránya lehet: A nagy hőmérséklet különbség miatt sók csapódhatnak ki.
• A fermentációs levegőáram sterilezése
A mikroorganizmusokra a legnagyobb veszélyt a levegővel bekerülő szennyeződések jelentik, ezért ennek sterilitására különösen kell figyelni. + Szűrés, besugárzás, hőkezelés + Régebben mélyszűrők (üveggyapot)
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
A B
C D E
10 4 F 10 8 x
t
A tenyészet fejlődésének szakaszai:
A. Lappangási (lag) szakasz
B. Gyorsuló növekedés szakasza C. Exponenciális növekedés
szakasza, korlátlan,
kiegyensúlyozott növekedés.
D. Lassuló, limitált vagy korlátozott szaporodás E. Stacionárius, stagnáló
szakasz
F. Hanyatló szakasz
ttg g – generációs idő (két egymást követő osztódás között eltelt idő)– generációs idő (két egymást követő osztódás között eltelt idő) tt – minimális és állandó generációs idő - C szakasz – minimális és állandó generációs idő - C szakasz
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
MI AZ OKA A HANYATLÓ FÁZISNAK?
1. TÁPANYAG LIMITÁCIÓ
2. TOXIKUS METABOLIT TERMÉK(EK) 3. HELYHIÁNY
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
x0 -a kiindulási mikrobakoncentráció n - a generációk száma
tg - a generációs idő
(két sejtosztódás között statisztikai átlagban eltelt idő)
A generációs idő függ a mikróba fajtól, a tenyésztési
körülményektől (tápanyag, hőmérséklet, pH, stb.), sőt még egy adott tenyésztés folyamán is változik.
x0 2x0 4x0 ... 2n x0
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
xx02n átrendezve: n x x
loglog log
0
2
nt tg
azaz logx xloglog t tg
02
logxlog xtt
g 0
2 vagymásformában: lnxln xtt
g 0
2 A generációk száma kifejezhető
A generációs idő kifejezhető
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
A növekedési sebesség arányos a jelenlévő mikróba-mennyiséggel A növekedési sebesség arányos a jelenlévő mikróba-mennyiséggel
1 x
dx
dt azegységnyimikrobatömegrevonatkoztatottszaporodás µµ - - Az exponenciális szakasz jellemző állandója (spec. növekedési sebesség)Az exponenciális szakasz jellemző állandója (spec. növekedési sebesség)
µµ értéke csak akkor állandó, ha értéke csak akkor állandó, ha minden tápanyag elegendő
minden tápanyag elegendő koncentrációban van jelen koncentrációban van jelen
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
x
max
max
S KS S µµmaxmax
A A µµxx és a szubsztrátkoncentráció kapcsolata (Monod modell)és a szubsztrátkoncentráció kapcsolata (Monod modell) S – nélkülözhetetlen tápanyagkomponens
S – nélkülözhetetlen tápanyagkomponens Ha S kicsi :
Ha S kicsi : µµ arányos S-el arányos S-el Ha S nagy telítettségi értékHa S nagy telítettségi érték
Ks- telítési állandó, megegyezik azzal a S-koncentrációval, ahol Ks- telítési állandó, megegyezik azzal a S-koncentrációval, ahol
µµ = = µµmaxmax 22
Ks – baktériumok Ks – baktériumok
glükóz 3-7 mg/l glükóz 3-7 mg/l
A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája
S x
dS
1 dt
P
x dP
1 dt
Y x
dx dt x
dS dt
dx dS
x S
1 1
µµxx - - Specifikus növekedési sebességSpecifikus növekedési sebesség
µµss - Specifikus szubsztrát-felhasználási sebesség - Specifikus szubsztrát-felhasználási sebesség µµpp - Specifikus termékképződési sebesség - Specifikus termékképződési sebesség
Y – hozamkonstans (
Y – hozamkonstans (a keletkező a keletkező baktériumtömeg/a felhasznált tápanyag) baktériumtömeg/a felhasznált tápanyag)
A növekedés és a tápanyag- A növekedés és a tápanyag-
felhasználás között egyszerű felhasználás között egyszerű
összefüggés összefüggés
Termékképződési kinetika
..\Képek\img002.jpg ..\Képek\img002.jpg
A termékképződési sebesség és a mikróba-koncentráció ill. a mikróba-növekedési sebesség közti kapcsolat
Termékképződési kinetika
µ µ
pp- Specifikus termékképződési sebesség - Specifikus termékképződési sebesség
Px
dP
1 dt
Különböző fermentációs típusok a
Különböző fermentációs típusok a µµxx, , µµss, , µµpp alapján alapján I. típus
I. típus II. típusII. típus
µµxx µµss µµpp
I.I. Termékképződés párhuzamos a növekedéssel (alkoholos erjesztés, Termékképződés párhuzamos a növekedéssel (alkoholos erjesztés, szorbózfermentáció…primer anyagcsere termék)
szorbózfermentáció…primer anyagcsere termék)
II.II. Termékképződés későn kezdődik – növekedéshez nem kapcsolódó Termékképződés későn kezdődik – növekedéshez nem kapcsolódó A legtöbb antibiotikum fermentáció – szekunder anyagcseretermék A legtöbb antibiotikum fermentáció – szekunder anyagcseretermék
Fermentáció típusok
Batch-fermentáció (szakaszos fermentáció): ez a fermentáció típus képezi az összes ma alkalmazott technika alapját, így a mennyiségi összefüggéseket ez alapján mutatjuk be
A paraméterek többségére nézve zárt rendszer
Feed-batch (rátáplálásos) fermentáció: a paraméterekre nézve „félig- nyitott” rendszer
Kezdetben nem az összes mikroorganizmust tápláljuk be, hanem szakaszosan rátáplálunk
A paraméterek követik a tápanyagtartalmat Folyamatos fermentáció:
Folyamatos tápoldat bevezetés, és termékelvétel
Folyamatos fermentáció előnyei
• Produktivitása 510- szer nagyobb, mint a szakaszos tenyésztésé
• Automatizálási lehetőség nagy, az üzem egésze folytonossá tehető
• Egyenletes terméket biztosít
Folyamatos fermentációs rendszerek
• Homogén rendszer
– A sejt és a szubsztrát-koncentráció teljesen egyöntetű
– Állandósult állapotú folytonos működés esetén az összes mikróba azonos környezeti feltételek között növekszik- azonos fiziológiai állapotban vannak a rendszeren belül
• Heterogén rendszer
– A sejtek és a szubsztrátok koncentráció-gradienst mutatnak – A mikróbák különböző fiziológiai állapotban vannak
• Zárt rendszerek
– A mikroorganizmusok mindig a rendszeren belül maradnak (szemipermeábilis hártya, állandó visszavezetés…)
Nyílt folytonos rendszerek osztályozása
• Homogén rendszerekHomogén rendszerek
•EgyfokozatúEgyfokozatú
•Kevert tankKevert tank
•Kevert tank Kevert tank visszatáplálással visszatáplálással
•TöbbfokozatúTöbbfokozatú
•Egyszerű láncEgyszerű lánc
• Többszöri szubsztrát Többszöri szubsztrát adagolás
adagolás
•Heterogén rendszerekHeterogén rendszerek
•EgyfázisúEgyfázisú
• csőreaktor csőreaktor
visszatáplálással visszatáplálással
•Többfázisú toronyTöbbfázisú torony
• folyadék-folyadékfolyadék-folyadék
• folyadék-gázfolyadék-gáz
Zárt folytonos rendszerek osztályozása
HomogénHomogén
kevert tank visszatáplálássalkevert tank visszatáplálással
HeterogénHeterogén
EgyfázisúEgyfázisú
Csőreaktor Csőreaktor
visszatáplálással visszatáplálással
Osztott tank Osztott tank
visszatáplálással visszatáplálással
KétfázisúKétfázisú
HártyatenyészetHártyatenyészet
Biotechnológiai termékek
Termék Felhasználás Termelő mikróba (forrás)
Gyümölcssavak pl.
citromsav, almasav Italok, dzsemek, szörpök Aspergillus niger, Candida lipolytica
Gyümölcssavak pl.
borostyánkősav Ízesítő, K-, Ca-, Mg-sók
mint NaCl helyettesítők Rhizopus, Mucor, Fusarium Vitaminok
(kobolamin, B12) Élelm. kiegészítés Propionibacterium shermanii Enzimek (proteázok) Tésztagyárt., italgyárt.,
sajtgyárt., húskészítmény Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Aspergillus orizae
Gélesítő anyagok Fagylalt, pudingok, habok Acetobacter vinelandii
ánizsaldehid illatanyag Trametes sauvolens
herbicidin herbicid Streptomyces saganonensis
indigó pigment Escherichia coli
CefalosporinC
(polipeptid) antibiotikum Cephalosporium acremonium Vankomicin
(glikopeptid) antibiotikum Streptomyces orientalis
IRODALOM, JEGYZET
•Nyeste Lajos: Biomérnöki műveletek és alapfolyamatok, Tankönyvkiadó, Budapest, 1990, J 6-816
•Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és alapfolyamatok, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem,
Műegyetemi Kiadó, Budapest, 2001
•Szabó István Mihály: A bioszféra mikrobiológiája, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1992