a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP

(1)

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

(2)

MOLEKULÁRIS MEDICÍNA ALAPJAI

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak

a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szerkesztette: Nagy László és Bálint Bálint László

Írták: Bálint Bálint L., Meskó Bertalan, Nagy László,

Lányí Árpád, Scholtz Beáta, Széles Lajos és Varga

Tamás

(3)

Molekuláris Medicína Alapjai

TÁMOP- 4.1.2-08/1/A-2009-0011 A projekt az Európai Unió támogatásával az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.

Bevezetés a molekuláris medicinába: Alapok

Nagy László

(4)

I. Alapok felfedezése

1869 F. Miescher svájci orvos savas anyagot izolált sejtek magjából elnevezte nukleinnek

1944 O. Avery A Pneumicoccus DNS-e tartalmazza a genetikai Információt

1950 E. Chargaff A-T, G-C ekvivalencia

1953 R. Franklin, M. Wilkins, J. Watson, F. Crick DNS kettőshelix szerkezete

1956 A. Kornberg DNS polimeráz

Később mRNS, plazmidok,bakteriális genetika, DNS manipulációk.

Mérföldkövek a molekuláris medicína

kialakulásában

(5)

II A módszertan kidolgozása

1960-as évek restrikcós endonukleázok, DNS ligáz H. Smith, D. Nathans, W. Arber

1972 P. Berg rekombináns DNS molekula

1976 első eukarióta gén (beta globin) klónozása T. Maniatis DNS szondák, hibridizáció= a DNS két szála szétválasztható és visszailleszthető

1975 szilárd fázisú hibridizáció E. Southern, Southern blot 1977 DNS szekvenálás F. Sanger, W. Gilbert

1978 Split genes W. Gilbert, P. Sharp, R. Roberts

1980 D. Botstein DNS polimorfizmus mint marker, emberi gén- Térkép

1987 R. Conn mitDNS az ember eredete Afrikából

Mérföldkövek a molekuláris medicína

kialakulásában

(6)

III. Modern éra (1980-2001)

Funkcionális klónozás (fehérjét használják a klónozásalapjául) talasszémiák

Pozícionális klónozás (nem kell fehérje hozzá) 1986 Krónikus granulomatózis betegség S. Orkin 1987 Duchenne muszkuláris disztrófia

2001 Humán genom megszekvenálása

Mérföldkövek a molekuláris medicína

kialakulásában

(7)

Pozícionális klónozással megtalált gének

Cisztikus fibrózis

Nuerofibromatózis 1,2

Tesztisz meghatározó faktor Fragilis X

Familiáris Adenomatózus Polipózis Miotóniás disztrófia

Huntington betegség

DNS repair defektus, ataxia teleangiektázia Bloom szindróma

Emlő tumor gének családi halmozódású esetekben

Hemokromatózis

(8)

Polimeráz Láncreakció PCR

1985 K. Mullis, R. Saiki Cetsu Corporation, Kalifornia Nobel prize 1993

DNS amplifikációnak nincs határa.

Humán Genom Program 1990-2000

1990-1995 HUGO

1996-2000 HGP

(9)

A Genom információja szabadon hozzáférhető

(10)

(11)

A Genom

Scholtz Beáta

(12)

Cirkuláris DNS a mitokondriumban

Kromoszómák a magban

Genetikai anyag lokalizációja

(13)

A humán kromoszómák

(14)

30X 10 000X 400 000X

A kromatin szerkezete a sejtben

(15)

myglassshallnotpersuademeiamoldsolongasyouthandthouareofo nedatebutwhenintheetimesfurrowsibeholdthenlookideathmydays shouldexpiateforallthatbeautythatdothcovertheeisbuttheseemlyr aimentofmyheartwhichinthybreastdothliveasthineinme:howcanit henbeelderthanthouartothereforelovebeofthyselfsowaryasinotfo rmyselfbutfortheewillbearingthyheartwhichiwillkeepsocharyaste ndernurseherbabefromfaringillpresumenotonthyheartwhenminei sslainthougavstmethinenottogivebackagai n

My glass shall not persuade me I am old, So long as youth and thou are of one date;

But when in thee time's furrows I behold, Then look I death my days should expiate.

For all that beauty that doth cover thee, Is but the seemly raiment of my heart, Which in thy breast doth live, as thine in me:

How can I then be elder than thou art?

O! therefore love, be of thyself so wary As I, not for myself, but for thee will;

Bearing thy heart, which I will keep so chary As tender nurse her babe from faring ill.

Presume not on thy heart when mine is slain, Thou gav'st me thine not to give back again

MBP H3K9 MET HP1

TSA, BUTYRATE, Valproic acid AZACYTIDINE

JMJ ACTIVATORS, Pargyline

A DNS nem lineáris szerkezetű

MBP

H3K9 MET HP1

(16)

Humán genom

Sejtmagban

> 3000 Mb

Mitokondrium 16 kb

Kódoló Nem kódoló

Intron, UTR Gének

egyedi v. repetitív

A humán genom szervezôdése

Nem-gén régiók egyedi v. repetitív

Ismert funkció

Szabályozó Strukturális

Funkció??

Nagyon sok repetitív szekv.

1-5%

45-50%

(17)

Repetitív szekvenciák: Pszeudogének

exon

intron DNS

mRNS

Transzkripció

DNS

Reverz transzkripció

(18)

A humán genom vizsgálata

Bálint Bálint L.

(19)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fred Sanger

A, G, T, C

A Sanger szekvenálás

(20)

1. Kromoszóma:

> 250 millió bp

2. DNS fragmentek:

150 ezer bp 3. Klónozás bakteriális kromoszómákba =

DNS könyvtár

4. Az inszertek kromoszomális helyét megállapítják

5. A nagy inszerteket tovább fragmentálják,

6. A kis fragmenteket is klónozzák, majd

szekvenálják

7. A szekvenciák átfedésébôl elôbb a nagy inszertek, majd a kromoszóma

szekvenciája megállapítható

Hierarchikus “shotgun” szekvenálás

(21)

Alkossunk Jobbat, Egyszerűbbet!

*Hagyjuk ki a baktériumokat!

*Sokszorozzunk DNS-t csupán enzimekkel!

(22)

“454” szekvenálási technológia

DNS könyvtár

1 DNS/ golyó

Olaj/viz mikroareaktoros amplifikálás

Golyók szétpakolása

Millió szekvenálás párhúzamosan

(23)

Gének és betegségek

Nagy László

(24)

A gének mindkét szálon kódolódhatnak

(25)

Mozgó genetikai elemek 1.

(26)

Mozgó genetikai elemek 2.

(27)

(28)

Duchene és Becker féle muszkuláris disztrófia

(29)

(30)

(31)

A kollagén rostok kialakulása és a mutációk hatása

(32)

A mutációk osztályozása

Deléció Inszerció

Egy bázispár helyettsítés missense

non-sense

splice site

framshift

dynamic

(33)

Loss of function= funkcióvesztő mutáns Gain of function= funkciónyerő mutáns

Haplo inszufficiencia Domináns negatív

Null allele / amorph

Hypomorph Neomorph

Hypermorph Antimorph

(34)

Hogyan rontható el egy gén ?

Deléció: teljes gén

a gén egy része Inszerció

A gén szerkezetének megváltoztatása transzlokáció

inverzió

A promoter aktivitásának a megváltozása mutáció

metiláció mRNS destabilizálása

poliA hely mutációja

non-sense mediated decay Splicing megakadályozása:

donor hely inaktiváció akceptor hely inaktiváció

splicing enhancer változtatása

Frame shift a transzlációban Kódon --- stop kódon

Esszenciális aminosav csere Poszttranszlációs processzálás Megakadályozása

A helyes celluláris elhelyezkedés

gátlása

(35)

Magreceptorok: túl a vízválasztón

Széles Lajos

(36)

A magreceptorok működésének általános mechanizmusa I.

DNA Ligand

N C

AF-2 AF-1

F E

D C

A/B

Ligand metabolizmus Közvetlen ligand

sejtmag

RXR

5’- AGGTCA -3’ ^DR

„üres” receptor

n

(37)

A magreceptorok csoportosítása

Endokrin receptorok

“adoptált” árva (orphan)

receptorok

árva (orphan) receptorok Nagy affinitású

hormonok

Alacsony affinitású, pl.

metabolitok

ismeretlen

ER PR AR GR MR

RAR TR VDR EcR

RXR PPAR LXR FXR

PXR/SXR CAR

SF-1 LRH-1 SHP TLX

NGFI-B ROR ERR HNF-4

COUP-TF

(38)

(39)

A magreceptorok működésének általános mechanizmusa III.

Több mint 300 különböző kofaktor létezik

HDAC gátlók új típusú antitumor gyógyszerek lehetősége (epigenetikai terápia)

SAHA (Vorinostat=suberoylanilide hydroxamic acid,

CTCL (T sejt lymphoma)

(40)

A microarray technológia alkalmazása a magreceptorok funkciójának

tanulmányozásában

(41)

RXR a

RAR a

RXR a

LXR a

RXR

a

9-cis RA

differentáció

Módosított zsírsavak

PPAR

g

differentáció

Lipid metabolizmus

Gyulladás Diabétesz (T2D)

Oxysterolok

Cholesterol metabolism

9-cis RA, rexinoids

ATRA

Gyulladás érelmeszesed és

RXR

a VDR

Retinoidok Vitamin D

differentáció

Csont anyagcsere

csontritkulás

immundeficiencák

RxR heterodimer magreceptorok

(42)

(43)

Személyreszabott genetika

Meskó Bertalan

(44)

ApoE és Alzheimer kór?

Apolipoprotein E két SNP ↓

4 génvariáns (E1-4) ↓

egy aminósav cseréjét jelentik ↓ E4 hajlamosít ↓

E2 kevésbé hajlamosít ↓

(45)

Génjeink

Egy gén által öröklött betegség

Több gén által örökített hajlam

Pl. színtévesztés vagy

vérzékenység

Pl. szívbetegség vagy

cukorbetegség

(46)

Az első lépések

Syncumar (Warfarin, Coumadin): véralvadásgátló Lényegében két gén befolyásolja a szervezetben a hatását:

 CYP2C9: két SNP lassítja a szer lebontását.

 VKORC1 : érzékennyé teszi az egyént a warfarinra.

USA: évente 30 millió ilyen gyógyszer, 43,000 sürgősségi beavatkozás

(47)

(48)

(49)

Környezet

Saját

Non-self

Veszelyes, Patogén

Immunrendszer

Tolerancia

Immune válasz

Az Immunrendszer, fekete doboz

(50)

Immundeficienciák

Lányi Árpád

(51)

(52)

IMMUNODEFICIENCIÁK

KOR ÉS EGÉSZSÉG FÜGGŐ

IMMUNOSZUPPRESSZÍV GYÓGYSZEREK ÖRÖKLÖTT

Az immunrendszer génjeinek funkció vesztéses mutánsai Fokozott érzékenység a fertőző

betegségekkel szemben Adott típusú patogénekkel

szembeni érzékenység függően a gén defektustól

1950 óta ismerik, az

antibiotikumok alkalmazása derített fényt a kórképek létezésére

SZERZETT

Fertőző betegségek AIDS

Más vírus fertőzések Alultápláltság

Mesterséges

immunszuppresszió

Gyógyszerek

Radioaktív besugárzás

(53)

ÖRÖKLÖTT IMMUNODEFICIENCIÁK

A LEGTÖBB EGY ADOTT GÉN RECESSZÍV MUTÁCIÓJA

A domináns öröklött immundeficienciák eliminálódtak a populációból

Autoszomális gén defektus

A betegség a homozigóta gyerekekben jelentkezik A heterozigóták hordozók

X-kromoszómához kapcsolt gének defektusai

Egy gén defektusa a férfiakban betegséget okoz

Egy gén defektusa a nőkben hordozóként jelentkezik

Az IFNγ receptor mutációja a citokin kötés mellett az

intracelluláris jelátvitel hiányát eredményezi - domináns

Kontrollálatlan fertőzés a Mycobacterium ártalmatlan,

vakcinációra használt törzsével szemben is (BCG oltás)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

AZ ÖRÖKLÖTT IMMUNODEFICIENCIÁK TÍPUSAI

B-SEJT DEFICIENCIA

-Extracell. Bakt. fertőzés

B sejt fejlődés

(XLA, IgA hiány)

B – T sejt együttműködés

CD40 ligand, hiper IgM

T SEJT DEFICIENCIA

SCID, fertőzés opportunista patogénekkel

T sejt fejlődés

IL-7/Jak3

Citoszkeleton

Tímusz epitél sejtek fejlődése

DiGeorge szindróma

Purin lebontás zavara DNS helyreállító enzim

defektus

MHC II szintézis gátolt

(59)

• KOMPLEMENT RENDSZER Extracelluláris bacteriális

fertőzés

• Oldott és sejtfelszíni faktorok

• C3

• C1 – C4

• Komplement gátló faktorok

FAGOCITA RENDSZER

• CD18 adhézió

• NADPH oxidáz

• Vezikuláris fúzió

A komplement rendszer és a fagocita rendszer különbségei

(60)

A daganatképződés molekuláris mechanizmusai 1.

Varga Tamás

(61)

Élet során létrejövő daganatok valószínűsége férfiakban, 2002- 2004*

Hely Risk

Összes 1 / 2

Prosztata 1 / 6

Tüdő 1 / 13

Colon, rectum 1 / 18

Hólyag 1 / 27

Melanoma 1 / 41

Non-Hodgkin/ lymphoma 1 / 46

Vese 1 / 59

Leukemia 1 / 67

Szájüreg 1 / 71

Gyomor 1 / 88

(62)

Összes 50 54 66

Női emlő 75 79 89

Colon 51 59 65

Leukemia 35 42 50

Tüdő 13 13 16

Melanoma 82 87 92

Non-Hodgk/ lymphoma 48 53 64

Petefészek 37 40 45

Pancreas 2 3 5

Prostata 69 76 99

Rectum 49 57 66

Hely 1975-1977 1984-1986 1996-2003

Trendek az öt éves túlélésben

(63)

Mortalitás USA, 2005

 1. Szív és érrendszer 652,091 26.6

 2. Daganat 559,312 22.8

 3. Stroke 143,579 5.9

 4. COPD 130,933 5.3

 5. Baleset 117,809 4.8

 6. Diabetes 75,119 3.1

 7. Alzheimer 71,599 2.9

 8. Léguti 63,001 2.6

 9. Nephritis 43,901 1.8

 10. Sepsis 34,136 1.4

Rank Halálok Esetszám %

(64)

(65)

(66)

A Daganatképződés

molekuláris mechanizmusai 2.

Varga Tamás

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

Elhízás molekuláris mechanizmusai

Bálint Bálint L.

(74)

(75)

(76)

(77)

Felmenő szignálok 1. Ízlelő bimbók

2. Gasztrointesztinális peptidek 3. Leptin

4. Vércukor szint

A központi szabályozó 1. Medialis hypothalamus

2. Histamin, szerotonin, dopamin, norepinefrin.

3. Neuropeptid Y, Agouti related peptid, ghrelin, orexin és opioids növelik az étvágyat

4. A-MSH, kokain, amfetamine és kortikotropin releasing hormon csökkentik az

étvágyat

(78)

Efferens szignálok

1. Növekedési hormon, tesztosteron és ösztrogén szabályozza a zsír eloszlását

2.Glukokortioidok szabályozzák a zsír differenciációt

3. Inzulin szükséges a zsír differenciációt és a lipolízist

(79)

(80)

Gyógyszeres célpontok 1. Pajzsmirigy kivonat 1893

2. Dinitrophenol 1920 3. Amphetamine 1930

4. Thyroid+digitalis+diuretics+amphetamine=Rain-bow pill (hirtelen halál)

5. Aminorex 1970= pulmonary hypertension 6. Alacsony kalória tartalmú diéta - halál